本發(fā)明專利技術屬于發(fā)酵技術領域，特別涉及一種發(fā)酵產(chǎn)4-Acetylantroquinonol?B的方法。牛樟芝是一種專性寄生于臺灣腐朽牛樟樹上的真菌，其子實體中含有多種天然活性物質，其中4-Acetylantroquinonol?B是近幾年從其子實體中分離出的一種具有較好的抗癌作用的物質，但目前牛樟芝的研究主要集中在提高菌體量、多糖產(chǎn)量方面，對樟芝特有的活性代謝產(chǎn)物4-Acetylantroquinonol?B為目標的發(fā)酵研究較少，本發(fā)明專利技術從牛樟芝菌種出發(fā)，通過分階段發(fā)酵培養(yǎng)、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組成的優(yōu)化，最終在不添加任何誘導物和前提物的情況下，從牛樟芝液體發(fā)酵所獲得的菌體中獲得4-Acetylantroquinonol?B，其產(chǎn)量達2.6-5mg/g。該方法是一種發(fā)酵生產(chǎn)4-Acetylantroquinonol?B的新方法。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
一種發(fā)酵生產(chǎn)4-AcetylantroquinonolB的方法
本專利技術屬于生物發(fā)酵
，特別涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)4-乙酰基安卓奎諾爾B(4-AcetylantroquinonolB)的方法。
技術介紹
牛樟芝子實體寄生于牛樟樹樹干腐朽的內壁或倒伏在地上靠近土表的無樹皮表面，具有強烈的牛樟樹香氣，含有高含量精油，外形呈板形、鐘形、馬蹄形或是不規(guī)則形狀，多年生、無柄，緊貼于木材表面生長。不少學者對牛樟芝子實體活性成分及其藥理活性進行了研究，證實牛樟芝子實體含有高氧化度三萜、活性多糖、甾醇等多種活性成分等。近年來，牛樟芝子實體中又分離鑒定出的了4-AcetylantroquinonolB等三萜類化合物，其在保肝、抗癌方面具有卓越的療效。Yu-WeiLin等已研究證實4-AcetylantroquinonolB在治療肝癌上有較好的效果；Tung-ChengChang等也已研究證實4-AcetylantroquinonolB在治療大腸癌上同樣具有較好的效果，其不僅能夠抑制癌細胞的增長，也能夠有效的降至癌細胞的抗藥性，是一種具有應用前景的癌癥治療藥物。但是，由于牛樟芝嚴格的寄主特性以及自然產(chǎn)量的稀少，而且其唯一寄主牛樟樹資源也十分匱乏，致使牛樟芝子實體遠不足供應市場需求且價格十分昂貴。而利用現(xiàn)代生物技術進行樟芝人工培養(yǎng)得到菌體產(chǎn)物是解決樟芝供需矛盾的有效解決方式，Yu-WeiLin等已經(jīng)從液體培養(yǎng)的牛樟芝菌體中鑒定出了4-AcetylantroquinonolB，但是其產(chǎn)量低；Chien-ChiChiang等采用液體發(fā)酵的方式，通過加入誘導物有效的提高了液態(tài)發(fā)酵的菌體中4-AcetylantroquinonolB的含量，最終其產(chǎn)量達0.8mg/g；因此通過液體發(fā)酵法來獲得4-AcetylantroquinonolB的研究仍處于初級階段，而不添加任何誘導物或前提物的條件下液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)4-AcetylantroquinonolB的研究尚未見報導。本專利技術從實驗室自主分離出的牛樟芝菌種出發(fā)，在不添加任何誘導物和前提物的情況下，分兩階段發(fā)酵培養(yǎng)，從牛樟芝液體發(fā)酵的菌體中獲得了較高產(chǎn)量的4-AcetylantroquinonolB。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術目的是克服現(xiàn)有技術產(chǎn)量低的不足，提供一種利用牛樟芝菌絲體發(fā)酵獲得高產(chǎn)量活性物質4-乙酰基安卓奎諾爾B(4-AcetylantroquinonolB)的新方法。本專利技術為實現(xiàn)上述目的采取以下技術方案，一種發(fā)酵生產(chǎn)4-AcetylantroquinonolB的方法，包括如下步驟：(1)菌種的擴大培養(yǎng)：以挖塊接種將牛樟芝菌接種至新的固體培養(yǎng)基中進行菌種的擴大培養(yǎng)，待固體培養(yǎng)基中形成新的牛樟芝菌落；(2)牛樟芝孢子懸液的制備：在新的固體培養(yǎng)牛樟芝菌落中加入無菌水，以玻璃棒刮下孢子，形成孢子懸液；(3)牛樟芝菌液體種子培養(yǎng)：將制備好的孢子懸液加入液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組成，使液體種子形成規(guī)則的小球狀；(4)第一階段液體發(fā)酵：將步驟(3)的液體種子接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，100-180rpm，20-26℃，培養(yǎng)8-12d；(5)第二階段液體發(fā)酵：第一階段發(fā)酵培養(yǎng)后，補加葡萄糖，調整發(fā)酵條件為180-220rpm，27-35℃，培養(yǎng)5-10d；(6)菌體干重的測定：發(fā)酵結束后取出菌體，抽濾，除去菌體中的液體培養(yǎng)基，再以去離子水沖洗2-3次，抽濾，烘干至恒重，測定其質量即為菌體干重；(7)菌體胞內物質提取：取烘干后的菌體，采用常規(guī)方法進行破胞處理并提取目標活性物質4-AcetylantroquinonolB。進一步地，所述步驟(1)中固體培養(yǎng)基組成為：葡萄糖10-30g/L，蛋白胨2-5g/L，麥芽浸粉10-30g/L，瓊脂20-35g/L。進一步地，所述步驟(2)孢子懸液中孢子數(shù)含量為106-107個/mL。進一步地，所述步驟(3)中液體種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖10-30g/L，蛋白胨5-15g/L，KH2PO40.5-2g/L，MgS04·7H2O0.05-0.2g/L，116℃滅菌25min。進一步地，所述步驟(4)中液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖15-25g/L，蛋白胨5-10g/L，K2HPO40.5-1.5g/L，MgS04·7H2O0.1-0.8g/L，麥芽浸粉15-25g/L，苯酚0.05-0.2g/L。進一步地，所述步驟(4)中液體種子的接種量為10％-30％。進一步地，所述步驟(5)中補加葡萄糖的質量按照每1L初始液體發(fā)酵培養(yǎng)基補加葡萄糖10-50g。進一步地，利用高效液相色譜對所述步驟(7)提取得到的目標活性物質4-AcetylantroquinonolB進行測定。與現(xiàn)有技術相比，本專利技術具有以下優(yōu)點和有益效果：(1)與其他培養(yǎng)方法相比，本專利技術所使用的方法在發(fā)酵過程中不添加任何誘導物或前提物的條件下獲得了活性物質4-AcetylantroquinonolB。(2)本專利技術所使用的兩階段發(fā)酵培養(yǎng)方法從牛樟芝菌絲體中獲得較高產(chǎn)量的活性物質4-AcetylantroquinonolB，產(chǎn)量最高可達5mg/g。具體實施方式下面結合具體實例進一步描述本專利技術，本專利技術的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實例僅是范例性的，并不對本專利技術的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本專利技術的精神和范圍下可以對本專利技術技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本專利技術的保護范圍內。下述實施例中的方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。本專利技術實施方式中所述牛樟芝或牛樟芝菌，優(yōu)選現(xiàn)有技術中一株Antrodiacamphorata(同義名:Taiwanofunguscamphorates；Ganodermacamphoratum；Antrodiacinnamomea)YMT1002菌株，該菌株子實體保藏于臺灣生物資源保存及研究中心(簡稱BCRC)(BCRCNumber：35396)，可通過購買方式獲得。本專利技術方法也可采用現(xiàn)有技術中其他牛樟芝菌株。實施例1以裝液量250mL的三角瓶發(fā)酵為例，牛樟芝液體種子培養(yǎng)的操作工藝如下：1)牛樟芝孢子的制備：利用挖塊接種法，將牛樟芝菌接種至新的固體培養(yǎng)基中，固體培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20g/L，蛋白胨2.5g/L，麥芽浸粉20g/L，瓊脂25g/L，避光培養(yǎng)20-25天后，新的圓形菌落形成，直徑約4-5cm，菌落中心呈橙色，邊緣呈白色，保存于4℃?zhèn)溆谩?)牛樟芝孢子懸液的制備：經(jīng)擴大培養(yǎng)后的新菌落可用于制備孢子懸液。4℃保存的菌種于室溫中放置1-2h后，無菌條件下加入10-15mL無菌水，用玻璃棒輕輕刮下菌落表面的孢子，最終菌懸液呈渾濁的橙色，其中孢子數(shù)為106-107個/mL。3)牛樟芝液體種子的制備：裝液量為100mL/250mL，培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，KH2PO41.5g/L，MgS04·7H2O0.1g/L，116℃滅菌25min。加入1-2mL制備好的孢子懸液，置于110rpm，25℃的恒溫搖床中培養(yǎng)3-4天，菌體呈規(guī)則球狀，直徑約為1-2mm，可接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中。實施例2以裝液量250mL的三角瓶發(fā)酵為例，牛樟芝液體發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)4-AcetylantroquinonolB的操作工本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
一種發(fā)酵生產(chǎn)4?Acetylantroquinonol?B的方法，其特征在于，包括如下步驟:(1)菌種的擴大培養(yǎng)：以挖塊接種將牛樟芝菌接種至新的固體培養(yǎng)基中進行菌種的擴大培養(yǎng)，待固體培養(yǎng)基中形成新的牛樟芝菌落；(2)牛樟芝孢子懸液的制備：在新的固體培養(yǎng)牛樟芝菌落中加入無菌水，以玻璃棒刮下孢子，形成孢子懸液；(3)牛樟芝菌液體種子培養(yǎng)：將制備好的孢子懸液加入液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組成，使液體種子形成規(guī)則的小球狀；(4)第一階段液體發(fā)酵：將步驟(3)的液體種子接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，100?180rpm，20?26℃，培養(yǎng)8?12d；(5)第二階段液體發(fā)酵：第一階段發(fā)酵培養(yǎng)后，補加葡萄糖，調整發(fā)酵條件為180?220rpm，27?35℃，培養(yǎng)5?10d；(6)菌體干重的測定：發(fā)酵結束后取出菌體，抽濾，除去菌體中的液體培養(yǎng)基，再以去離子水沖洗2?3次，抽濾，烘干至恒重，測定其質量即為菌體干重；(7)菌體胞內物質提取：取烘干后的菌體，采用常規(guī)方法進行破胞處理并提取目標活性物質4?Acetylantroquinonol?B。
【技術特征摘要】
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)4-AcetylantroquinonolB的方法，其特征在于，包括如下步驟:（1）菌種的擴大培養(yǎng)：以挖塊接種將牛樟芝菌（Antrodiacamphorata）接種至新的固體培養(yǎng)基中進行菌種的擴大培養(yǎng)，待固體培養(yǎng)基中形成新的牛樟芝菌落；所述牛樟芝菌為AntrodiacamphorataBCRC35396菌株；（2）牛樟芝孢子懸液的制備：在新的固體培養(yǎng)牛樟芝菌落中加入無菌水，以玻璃棒刮下孢子，形成孢子懸液；（3）牛樟芝菌液體種子培養(yǎng)：將制備好的孢子懸液加入液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組成，使液體種子形成規(guī)則的小球狀；（4）第一階段液體發(fā)酵：將步驟（3）的液體種子接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，100-180rpm，20-26℃，培養(yǎng)8-12d；液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖15-25g/L，蛋白胨5-10g/L，K2HPO40.5-1.5g/L，MgS04·7H2O0.1-0.8g/L，麥芽浸粉15-25g/L，苯酚0.05-0.2g/L；（5）第二階段液體發(fā)酵：第一階段發(fā)酵培養(yǎng)后，補加葡萄糖，調整發(fā)酵條件為180-220rpm，27-35℃，培養(yǎng)5-10d；補加葡萄糖的質量按照每1L初始液體發(fā)酵培養(yǎng)基補加葡萄糖10-50g；（6）菌體干重的測定：發(fā)酵結束后取出菌體，抽濾，除去菌體中的液體培養(yǎng)基，再以去離子水沖洗2-3次，抽濾，烘干至恒重，測定其質量即為菌體干重；（7）菌體胞內物質提取：取烘干后的菌體，采用常規(guī)方法進行破胞處理并提取目標活性物質4-AcetylantroquinonolB。2.如權利要求1所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)4-AcetylantroquinonolB的方法，其特征在于，所述步驟（1）中固體培養(yǎng)基組成為：葡萄糖10-30g/L，蛋白胨2-5g/L，麥芽浸粉10-30g/L，瓊脂20-35g/L。3.如權利要求1所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)4-AcetylantroquinonolB的方法，其特征在于，所述步驟（2）孢子懸液中含有孢子數(shù)為106-107個/mL。4.如權利要求1所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)4-AcetylantroquinonolB的方法，其特征在于，所述步驟（3）中液體種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖10-30g/L，蛋白胨5-15g/L，KH2PO40.5-2g/L，MgS04·7H2O0.05-0.2g/L，116℃滅菌25mi...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：鄧利，劉歡，王萌，曾耀銘，
申請(專利權)人：廈門北化生物產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：福建;35
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