本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種越南槐內(nèi)生細(xì)菌B22，越南槐內(nèi)生菌B22的分類命名為微桿菌(Microbacterium?sp.)B22，菌株的16S?rDNA基因序列表如SEQ?ID?NO.1所述，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期：2015年09月29日，保藏號：CGMCC?No.11463。本發(fā)明專利技術(shù)首次從藥用植物越南槐的根中分離篩選到一株越南槐內(nèi)生細(xì)菌(Microbacterium?sp.)B22，該菌對三七根腐病菌具有很強(qiáng)的抑制作用，為三七真菌病害的生物防治領(lǐng)域帶來廣闊的應(yīng)用前景。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物
，特別涉及一種越南槐內(nèi)生細(xì)菌B22在防治三七根腐病 中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
現(xiàn)代農(nóng)業(yè)對植物病害的防治過度依賴于化學(xué)農(nóng)藥的使用，大量化學(xué)農(nóng)藥的施放不 僅對生態(tài)環(huán)境具有長期的破壞作用，也引起農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降，農(nóng)藥殘留超標(biāo)、病原菌的耐藥 性以及對人畜有害等諸多問題。尋找更為安全、有效的病害防治方法具有重大的意義，利用 生物的方法來防治植物病害可以有效解決上述問題。 三七(PanaxnotoginsengF.H.chen)又名田七、金不換等，具有顯著的活血化瘀、 消腫定痛功效，是一種中國傳統(tǒng)名貴藥材。以三七為主要原料制成的中成藥如"云南白藥" 和"片仔癀"等廣為流傳。近年來，對三七原材料的需求日益增長。但是栽培過程中的真菌病 害嚴(yán)重影響了三七生長。目前，在三七種植上，防治真菌病害過度依賴化學(xué)農(nóng)藥，大量化學(xué) 農(nóng)藥的使用不僅影響了三七的品質(zhì)，也造成了三七藥材的大量農(nóng)藥殘留。 三七根腐病為三七主要病害之一，在產(chǎn)區(qū)俗稱"綠臭"，主要癥狀為苗期的芽腐及 其蘆頭和芽基結(jié)合處的褐色水漬狀病變直至蔓延至整個莖桿基部。該病出苗期就有發(fā)生， 4、5月病害停滯，6-9月進(jìn)入多雨季節(jié)，進(jìn)入發(fā)病高峰期。根腐病有多種類型，據(jù)報道其癥狀 大都由三七根腐病菌(Fusariumsolani)(簡稱F.solani)引起。這個真菌病害是造成多年來三七產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量下降的主要原因之一。在廣西三 七的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)，由于低海拔及高溫多濕的氣象條件，這種病害往往是同時發(fā)生的，造成 了三七的大量減產(chǎn)甚至絕收，給種植戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了控制這個真菌病害，大 量的化學(xué)農(nóng)藥被使用，造成了三七產(chǎn)品的大量農(nóng)藥殘留，嚴(yán)重的污染了環(huán)境，大大的威脅了 人們的健康。因此，開展生物防治三七真菌病害對三七產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展是非常迫切和必 要的。為此篩選出能同時拮抗這種病害的拮抗菌具有重大意義，篩選進(jìn)而開發(fā)利用拮抗菌 也是有效控制三七真菌病害最具發(fā)展?jié)摿Φ姆乐未胧┲弧９_于該
技術(shù)介紹
部分的信息僅僅旨在增加對本專利技術(shù)的總體背景的理解，而不應(yīng) 當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種越南槐內(nèi)生細(xì)菌B22在防治三七根腐病中的應(yīng)用，從 而能有效的防治三七種植過程中出現(xiàn)的三七根腐病，從而提高三七的產(chǎn)量以及質(zhì)量。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)提供的技術(shù)方案如下： -種越南槐內(nèi)生細(xì)菌B22,越南槐內(nèi)生菌B22的分類命名為微桿菌 (Microbacteriumsp.)B22,菌株的16SrDNA基因序列表如SEQIDNO. 1所述，保藏單位：中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3 號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期:2015年09月29日，保藏號:CGMCCNo. 11463。優(yōu)選的是，所述越南槐內(nèi)生細(xì)菌B22代謝產(chǎn)物的制備方法為：將越南槐內(nèi)生細(xì)菌B22接種于NB液體培養(yǎng)基中，置于溫度為28°C、轉(zhuǎn)速為130r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)10天，所得 發(fā)酵物經(jīng)減壓濃縮干燥后，加入發(fā)酵物2倍的甲醇并超聲40min，然后離心，取上清液減壓濃 縮得到菌株發(fā)酵物的甲醇粗提物，即為越南槐內(nèi)生細(xì)菌B22代謝產(chǎn)物。優(yōu)選的是，所述越南槐內(nèi)生細(xì)菌B22接種于含1000mlNB液體培養(yǎng)基。優(yōu)選的是，所述的NB液體培養(yǎng)基含牛肉浸膏3g，酵母膏l(xiāng)g，蛋白胨5g，鹿糖10g，培 養(yǎng)基pH值為7.0。如上述制備所得越南槐內(nèi)生細(xì)菌B22的代謝產(chǎn)物在防治三七根腐病中的應(yīng)用。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有如下有益效果： 本專利技術(shù)首次從藥用植物越南槐的根中分離篩選到一株越南槐內(nèi)生細(xì)菌 (Burkholderiasp. )B22，該菌對三七根腐病菌具有很強(qiáng)的抑制作用，為三七真菌病害的生 物防治領(lǐng)域帶來廣闊的應(yīng)用前景。【附圖說明】 圖1是本專利技術(shù)越南槐內(nèi)生細(xì)菌B22與三七根腐病的平板對峙培養(yǎng)，其中F為三七根 腐病菌(Fusariumsolani)，a為空白對照，b為實(shí)驗(yàn)組。圖2是本專利技術(shù)越南槐內(nèi)生細(xì)菌B22菌株形態(tài)特征，其中，al為菌落形態(tài)，b1為菌體形 ??τ〇圖3為越南槐內(nèi)生細(xì)菌Β22菌株基于16SrDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖4是根據(jù)本專利技術(shù)菌株越南槐內(nèi)生細(xì)菌B22的代謝產(chǎn)物對三七根腐病菌的菌絲生 長的抑制效果;其中第1、第5個為空白對照即不含藥的PDA平板;第2、第3、第4個為陽性對照 多菌靈粉劑;第6、第7、第8為B22菌株的代謝產(chǎn)物，且濃度分別為2mg/ml，4mg/ml，8mg/ml;F 為三七根腐病菌Fusariumsolani〇【具體實(shí)施方式】 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本專利技術(shù)的保護(hù)范圍并不受具體 實(shí)施方式的限制。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施 例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。甲醇為市購分析純甲醇。 2XTagMasterMix購自寶生物工程有限公司（Takara)，Primer_l、Primer_2由華大基因合 成。 實(shí)施例1菌株的分離、篩選及鑒定 一、菌株的分離供試材料:采自廣西天等縣石灰?guī)r地區(qū)的野生越南槐。供試菌株:由廣西大學(xué)植物病理研究所提供。培養(yǎng)基：1000mlNA培養(yǎng)基：牛肉浸膏3g，酵母膏l(xiāng)g，蛋白胨5g，鹿糖10g，瓊脂15g，pH7.0〇 表面消毒:將長為6-8cm、寬為l-2cm新鮮健康的越南槐根用流水沖洗30min以沖干 凈泥沙，然后將洗凈的越南槐根用無菌水漂洗2次，風(fēng)干表面水分，移到超凈工作臺，在無菌 條件下，將越南槐根用體積濃度為75%乙醇浸泡lmin，無菌水漂洗2次，次氯酸鈉(有效氯 1 % )浸泡2min，無菌水洗3次，無菌吸水紙吸干表面?zhèn)溆谩＞甑姆蛛x、純化:表面消毒好的越南槐根，無菌條件下，用無菌木片刮去表皮，用 無菌枝剪剪去越南槐根的兩端，余下部分用無菌小刀和無菌鑷子分開木質(zhì)部和韌皮部，分 別取0.5cm長的組織塊，用無菌枝剪剪碎并加無菌水研磨，研磨充分后加無菌水定容至5ml 并靜置lOmin，取0.5ml上清液梯度稀釋10~105倍，分別取100yL稀釋液涂布到ΝΑ平板上，每 個稀釋濃度重復(fù)3次，取最后一次漂洗液涂布在ΝΑ平板上，作為陰性對照。ΝΑ平板置于培養(yǎng) 箱28°C恒溫培養(yǎng)24~96h，挑取不同形態(tài)菌落反復(fù)劃線純化，將純化的菌株，即越南槐內(nèi)生 細(xì)菌用20 %甘油保存。將分離到的越南槐內(nèi)生細(xì)菌接種于LA平板上，28°C下培養(yǎng)24h后待用。將三七根腐 病菌接種于PDA平板，28°C下培養(yǎng)3天后待用。二、篩選采用平板對峙法對供試越南槐內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行菌體抑菌活性的初篩。首先，無菌條件下，用滅菌打孔器將三七根腐病菌制成6mm菌餅;在處理中，將三七 根腐病菌菌餅轉(zhuǎn)接到含NA的培養(yǎng)皿中央，然后在距離菌餅2cm的位置，將分離到的越南槐內(nèi) 生細(xì)菌菌株接上一條細(xì)菌線，每株內(nèi)生細(xì)菌重復(fù)3皿;在對照組中，只接三七根腐病菌菌餅， 不接越南槐內(nèi)生細(xì)菌，重復(fù)3皿。然后，在28°C下培養(yǎng)，定期觀測。待對照組中真菌長滿培養(yǎng) 皿時，在處理組中，測量三七根腐病菌菌餅中心到越南槐內(nèi)生細(xì)菌線中心之間三七根腐病 菌的生長半徑為處理生長半徑;在對照組中，三七根腐病菌的生長半徑本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種越南槐內(nèi)生細(xì)菌B22，其特征在于：越南槐內(nèi)生菌B22的分類命名為微桿菌(Microbacterium?sp.)B22，保藏號：CGMCC?No.11463。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：黃榮韶，藍(lán)芳，姚裕群，李良波，
申請(專利權(quán))人：廣西大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：廣西;45
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