本發明專利技術公開了一種防治作物黃萎病的多粘類芽孢桿菌及其應用，該菌株被命名為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus?polymyxa)SX-3，保藏號為CGMCC?11638。本發明專利技術提供了一種含有所述多粘類芽孢桿菌的菌劑。本發明專利技術菌株對大麗輪枝菌孢子萌發及菌絲生長都有抑制效果，具有高效拮抗作用。本發明專利技術菌株能用于大麗輪枝菌引起的作物黃萎病的防治，對棉花黃萎病有顯著防治效果，盆栽試驗防效達到86％以上；且作物發病后期，用包含有本發明專利技術菌株的菌液灌根，仍具有明顯的治療效果，所以，本發明專利技術菌株作為生物農藥應用具有很大的潛力。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于微生物種質資源的開發與利用領域，具體涉及一種用于防治大麗輪枝菌引起的作物黃萎病的多粘類芽孢桿菌及其應用。
技術介紹
大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)屬于子囊菌門真菌，主要以微菌核在土壤、病殘組織、帶菌的種子和未經腐熟的土雜肥上越冬，可為害38科660種植物，其中大田作物包括棉花、向日葵、茄子、辣椒、番茄、煙草、馬鈴薯等，引起的病害稱為黃萎病。越冬后的微菌核萌發，產生大量的分生孢子，分生孢子萌發侵入根毛、根表皮細胞或根部傷口，經過皮層進入導管，破壞植物的維管束系統，并在侵染過程中產生毒素，導致作物萎蔫死亡給農業生產帶來嚴重損失。病原菌產生的黑色微菌核具有抗逆性，且具有積累效應，可在土壤中可存活多年，而引起的作物黃萎病是生產中最難防治的病害之一。長期以來，農業生產中防治黃萎病主要以培育抗病品種和使用化學殺菌劑為主，但針對大麗輪枝菌的作物抗病性幾乎沒有獲得完全抗病的品種。主要原因是大麗輪枝菌易變異，新培育的抗病品種很快喪失了抗病性。生產上主要依賴化學殺菌劑，而大量使用化學藥劑對人類健康潛在的危害、對食品和環境的污染、對非靶標生物的影響以及導致病原菌抗藥性的加速發展等問題已經引起社會的日益關注，減量使用化學農藥是發展的必然趨勢。隨著隨經濟的發展和人類生活質量的提高，對農產品安全和農業的可持續發展越來越關注，這也促使了生物防治的發展。幾年來國內外大量研究表明，利用拮抗微生物研發生防制劑，具有廣闊的前景。一方面，微生物種群豐富，而且可通過生物工程技術大幅度提高目標活性物質的產量，易于實現工業化生產；另一方面，微生物制劑本身來源于自然界，易于降解，對環境友好、安全，已有大量的生防產品應用于植物病害防治。在病害防治中，研究集中于芽孢桿菌研發和利用。這是因為芽孢桿菌能分泌多種拮抗化合物，能有效抑制多種植物病原菌。由于這類細菌擁有芽孢，它們對輻射、熱、干燥、極端pH值和一些有毒化學物品等有很強的抵抗能力，在一定條件下，內生芽孢在休眠狀態下可以保持活力數年至數十年之久；同時，內生芽孢繁殖速度快、營養要求簡單和易于在植物根圈定殖的特點，因而利用這些細菌研發的生防制劑已被廣泛應用于植物病害的防治方面。我國芽孢桿菌BI30制成的泥炭制劑對生姜青枯病以及枯草芽孢桿菌TG26對煙草青枯病防效達90％以上。多粘類芽孢桿菌屬芽孢桿菌類，其拮抗機制主要是分泌的拮抗化合物、溶菌酶等。然而，不同的種類，甚至同種的不同來源株系間的拮抗效果差異很大。雖然國內外都已有多粘類芽孢桿菌制劑，但由于菌株的多樣性，不同多粘類芽孢桿菌菌株仍具有不同的抗菌譜、抗菌活性和抗菌特點，篩選不同作用對象的高效菌株仍是現在乃至今后相對長的一段時間內各國科研工作關注的方向。
技術實現思路
本專利技術提供了一種防治作物黃萎病的多粘類芽孢桿菌，該菌株對大麗輪枝菌引起的棉花黃萎病的防效達86％以上。一種多粘類芽孢桿菌，分類命名為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)SX-3，保藏于位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，保藏日期為2015年11月11日，保藏號為：CGMCCNo.11638。該菌株主要形態及生物學特征為：革蘭氏染色反應陽性，菌體桿狀，無鞭毛，大小約為0.58μm×2.9μm，菌落表面光滑，呈乳白色。該菌株16SrDNA序列分析顯示其與GenBank號為JX849658.1或KR010176.1的多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)一致性為99％。本專利技術提供了一種含有所述多粘類芽孢桿菌的菌劑，該菌劑的濃度優選為1×107～1×108CFU/mL，更優選為1×108CFU/mL。本專利技術提供了所述菌劑的制備方法，包括：將所述多粘類芽孢桿菌接種于培養液中，培養至OD600為0.6～0.8，獲得種子液；所述培養液可選用LB液體培養基，其配方為：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化鈉10g/L，調節pH為7.0～7.2。將種子液接種于發酵培養基中擴大培養，調節發酵液中多粘類芽孢桿菌的濃度至1×107～1×108CFU/mL，即獲得所述菌劑。其中，所述種子液的接種量優選為1～2％；所述發酵培養基為：先將淀粉糊化，再加入到含有酵母粉、蛋白粉、葡萄糖、MgSO4、KH2PO4、CaCO3的培養基中，121℃滅菌30分鐘。本專利技術中，所述擴大培養是在發酵罐中進行，培養本專利技術菌株時的溫度、pH、通氣量、罐壓、轉速等條件沒有特別嚴格的要求，只要該條件適合所述菌生長即可。在一些較佳實施方案中，通氣比為0.4～2∶1，轉速為300～800rpm，pH宜在6～7.5之間，培養溫度宜在28～35℃之間，培養時間在48～72h之間。最終菌濃度通常可達1×1010～1×1011CFU/mL，調節菌懸液濃度至1×107～1×108CFU/mL施用。本專利技術提供了所述多粘類芽孢桿菌在拮抗大麗輪枝菌中的應用。在平板拮抗試驗中，本專利技術菌株對大麗輪枝菌孢子萌發的抑菌圈直徑為4.2cm，對菌絲生長的抑制率達75％，菌絲被抑制后不能形成輪枝，出現明顯的膨大、消解等畸形現象。本專利技術提供了所述多粘類芽孢桿菌在防治作物黃萎病中的應用。所述作物可以是棉花、向日葵、茄子、番茄、煙草或馬鈴薯，優選為棉花。防治棉花黃萎病可以按如下方法操作：在棉花3～4葉期，將所述菌劑澆在苗床上或對植株灌根處理，防治5天后接種大麗輪枝菌，接種20天后，防效仍達86％以上；或將所述菌劑灌根于已發病植株，一周后，病株莖基部維管束變褐癥狀消失。本專利技術多粘類芽孢桿菌對大麗輪枝菌具有高效拮抗作用，能用于大麗輪枝菌引起的作物黃萎病的防治，棉花盆栽試驗防效達86％以上；且作物發病后期，用包含有本專利技術菌株的菌液灌根，仍具有明顯的治療效果，所以，本專利技術菌株作為生物農藥應用具有很大的潛力。附圖說明圖1為本專利技術多粘類芽孢桿菌的菌落特征圖；圖2為本專利技術多粘類芽孢桿菌的電鏡圖；圖3為本專利技術多粘類芽孢桿菌對大麗輪枝菌的分生孢子抑制作用圖，左邊實驗組，右邊為對照組；圖4為本專利技術多粘類芽孢桿菌對大麗輪枝菌菌絲的抑制作用圖，左邊為實驗組，右邊為對照組；圖5為大麗輪枝菌菌絲生長被本專利技術多粘類芽孢桿菌抑制后的顯微觀察圖；圖6為大麗輪枝菌菌絲生長被本專利技術多粘類芽孢桿菌抑制后的顯微觀察圖。具體實施方式實施例1菌株分離篩選供試土樣采自河北農科院連作的棉花病苗圃和陜西省三元縣西北農林科技大學連作的棉花試驗田中，隨機采集土樣于無菌袋中，密封后于4℃冰箱中保存。雙層平板法篩選土壤中的生防細菌。將培養4-5天的大麗輪枝菌打菌餅于無菌水中，配制濃度為106個/mL的孢子懸浮液。取適量(1g)土樣于無菌水中配制成土壤懸浮液，系列稀釋至10-2-10-3。雙層平板法：將配制的大麗輪枝菌孢子懸浮液均勻涂布PDA上，28℃下生長48h后，倒LB于PDA上層，均勻涂布土壤懸浮液。將平板置本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種多粘類芽孢桿菌，其特征在于，命名為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus?polymyxa)SX?3，保藏號為：CGMCC?11638。
【技術特征摘要】
1.一種多粘類芽孢桿菌，其特征在于，命名為多粘類芽孢桿菌
(Paenibacilluspolymyxa)SX-3，保藏號為：CGMCC11638。
2.一種包含如權利要求1所述多粘類芽孢桿菌的菌劑。
3.如權利要求2所述的菌劑，其特征在于，所述多粘類芽孢桿菌的
濃度優選為1×107～1×108CFU/mL。
4.如權利要求1所述的多粘類芽孢桿菌在拮抗大麗輪枝菌中的應用。
5.如權利要求1所述的多粘...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張敬澤，李曉林，祝水金，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：浙江;33
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