一種番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法，其包括：1)從番茄葉中提取待檢測番茄葉片DNA；2)以上述番茄葉片提取獲得的DNA為模板，利用Ty-2和ty-5的引物，通過建立的多重PCR反應(yīng)體系，對(duì)待測樣品進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；3)PCR產(chǎn)物電泳檢測；4)對(duì)待測番茄樣品中是否含有Ty-2基因和ty-5基因進(jìn)行鑒定等步驟。本發(fā)明專利技術(shù)用于快速鑒定番茄材料中是否含有番茄黃化曲葉病抗性基因Ty-2和ty-5，有利于對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行聚合育種時(shí)，對(duì)抗病基因材料的篩選。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物檢測
，具體涉及一種番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法。
技術(shù)介紹
番茄是一種重要的蔬菜作物，近年來受到番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)病的危害，使我國番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到了嚴(yán)重的影響。該病害由攜帶番茄黃化葉病毒的煙粉虱進(jìn)行傳播，由于栽培番茄中起初都不含有抗病基因，植株被TYLCV侵染后，生長受到嚴(yán)重抑制，易落花落果。如果苗期感病，危害嚴(yán)重時(shí)，甚至造成絕產(chǎn)絕收，對(duì)番茄生產(chǎn)造成了巨大的影響。而在野生番茄中發(fā)現(xiàn)的抗TYLCV基因，經(jīng)過鑒定發(fā)現(xiàn)，對(duì)該病具有很好的抗性。已知的番茄抗TYLCV基因有，Ty-1，Ty-2，Ty-3，Ty-3a，Ty-4，Ty-5和Ty-6。在我國的番茄品種中應(yīng)用較多的抗病基因是Ty-1，Ty-2，Ty-3，Ty-3a。由于TYLCV變異性強(qiáng)，長期使用現(xiàn)有抗原容易使病毒突破抗病基因的抗性。通過對(duì)含有ty-5材料1227的引進(jìn)和抗性鑒定，確定該基因?qū)YLCV具有很高的抗性，選育含有ty-5基因的番茄材料，并用于番茄品種中，可以豐富現(xiàn)有品種中抗原的種類，增強(qiáng)番茄對(duì)TYLCV的長久抗性。目前在番茄抗TYLCV育種過程中，選育含有多個(gè)抗TYLCV基因的品種，可以顯著的增強(qiáng)品種的抗性水平?；谏鲜鲈?，選育同時(shí)含有Ty-2和ty-5的番茄材料具有重要的意義。在對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行聚合育種的過程中，對(duì)分離群體進(jìn)行抗性鑒定后，所獲得的抗TYLCV植株無法確定其中含有Ty-2還是ty-5。利用分子標(biāo)記的手段，可以不通過抗性鑒定，就可以判斷植株中所含的是哪個(gè)抗病基因，加快了對(duì)育種材料的選擇，縮短了育種的進(jìn)程。目前，Ty-2基因被定位在番茄11號(hào)染色體長臂端，與SCAR標(biāo)記T0302連鎖。ty-5基因被定位在番茄4號(hào)染色體上，與CAPS標(biāo)記SlNAC1連鎖，該標(biāo)記也是目前已知的唯一與ty-5連鎖的分子標(biāo)記。雖然利用Ty-2和ty-5的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇可以加快對(duì)含有基因材料的篩選，但是如果可以建立這兩個(gè)基因的多重PCR體系，可以在原來的基礎(chǔ)上將工作效率提高一倍，鑒定成本減少一半，更加有利于對(duì)抗病基因的篩選。但目前的ty-5基因連鎖標(biāo)記為CAPS標(biāo)記，所用的內(nèi)切酶為TaqI，在于Ty-2基因的連鎖標(biāo)記構(gòu)建多重PCR體系時(shí)，由于標(biāo)記類型和內(nèi)切酶的差異，無法實(shí)現(xiàn)。至今，仍無這兩個(gè)基因的多重PCR體系。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本專利技術(shù)的目的在于提供一種番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法，用于快速鑒定番茄材料中是否含有番茄黃化曲葉病抗性基因Ty-2和ty-5，有利于對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行聚合育種時(shí)，對(duì)抗病基因材料的篩選。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)所采用的技術(shù)方案如下：一種番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法，其包括以下步驟：1)從番茄葉中提取待檢測番茄葉片DNA；2)以上述番茄葉片提取獲得的DNA為模板，利用Ty-2和ty-5的引物，通過建立的多重PCR反應(yīng)體系，對(duì)待測樣品進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；3)PCR產(chǎn)物電泳檢測；4)對(duì)待測番茄樣品中是否含有Ty-2基因和ty-5基因進(jìn)行鑒定。進(jìn)一步的方案，本專利技術(shù)所述的步驟1)中的番茄葉取自育種、野生、分離群體番茄品種的番茄葉。進(jìn)一步的方案，本專利技術(shù)所述的步驟2)中，Ty-2引物為：Ty1-F:CAACAGCAATGTACCTGGTCAGTy1-R:CTGTGGCATACGTTGGTGACAC；ty-5引物為：ty5-17R：TAACAAAGCCCTCAAAGCty5-17F：GTCTCCGAAACGTAATCC。進(jìn)一步的方案，本專利技術(shù)所述的步驟2)中，多重PCR反應(yīng)體系為：10ng/μL模板DNA2μL，4pmmol/L的引物對(duì)T0302R/F與ty5-17R/F各0.5μL，mix酶10μL，雙蒸水或三蒸水加至20μL；多重PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；每個(gè)循環(huán)95℃變性45sec，54℃退火45sec，72℃延伸45sec，共38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。進(jìn)一步的方案，本專利技術(shù)所述的步驟3)中，電泳采用8％的聚丙烯酰胺凝膠，電泳的具體步驟包括：a)制備聚丙烯酰胺凝膠：KOH溶液浸泡玻璃板一定時(shí)間，用去污劑和清水清洗干凈，最后用雙蒸水沖洗，晾干后用乙醇擦拭長短板；然后將長板處理面向上，短板處理面向下蓋到長板上，用橡膠條固定兩個(gè)板，插入垂直電泳儀支架，短板向里固定，即凹口板面向電泳液方向，用1％的瓊脂糖密封橡膠條與玻璃板之間的縫隙；在30％的丙烯酰胺溶液加入10×TBE、雙蒸水、TEMED以及10％的APS配置成8％的聚丙烯酰胺溶液；然后將電泳槽傾斜30度，緩緩地使聚丙烯酰胺溶液倒入兩板間，等膠溶液快要溢出時(shí)，把玻璃板放平，用薄塑料板趕氣泡，倒插梳子；灌完膠后，放于室溫讓其自然凝固，觀察膠邊沿出現(xiàn)折射線就表明膠已凝固；b)聚丙烯酰胺凝膠電泳：向電泳儀下端槽內(nèi)倒1xTB，向上槽倒1×TBE，使液面高于短板上沿，拔出梳子，并用注射器吸取適量電泳液把點(diǎn)樣孔洗干凈；取PCR產(chǎn)物上樣；調(diào)節(jié)電壓160V，電泳1.5-2.0h，電泳完畢；c)聚丙烯酰胺凝膠電泳的顯色：把經(jīng)冷卻的膠板置于盛有固定液的塑料盤中，搖床震蕩3-8min；然后將膠板置于盛有染色液的塑料盤中，搖床震蕩10-15min；經(jīng)染色的膠板用雙蒸水清洗，然后用添加了濃度為10％的Na2S2O3的雙蒸水清洗；將清洗干凈的膠板置于顯色液中顯色，至DNA條帶清晰后將顯色完畢的膠板放回固定液中反應(yīng)，反應(yīng)完成后用雙蒸水清洗，然后用保鮮膜密封，置于室溫自然干燥，條帶統(tǒng)計(jì)、拍照留存。進(jìn)一步的方案，本專利技術(shù)所述的固定液由0.5％乙酸2.5mL、10％乙醇50mL、雙蒸水450mL組成；所述染色液由硝酸銀與雙蒸水組成，其中硝酸銀與雙蒸水的質(zhì)量比為1:500。進(jìn)一步的方案，本專利技術(shù)所述的所述顯色液由7.5gNaOH、37％-40％的甲醛1.5mL、雙蒸水500mL組成。進(jìn)一步的方案，本專利技術(shù)所述的步驟4)中，對(duì)待測樣品中Ty-2基因和ty-5基因進(jìn)行鑒定方法具體步驟為：在步驟3)酶切后的多態(tài)性條帶中大找出750bp和172bp條帶，即分別對(duì)應(yīng)Ty-2基因和ty-5基因。相比現(xiàn)有技術(shù)，本專利技術(shù)的有益效果在于：1本專利技術(shù)所述的番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法可以用于對(duì)番茄材料和群體中是否含有Ty-2基因和ty-5基因這兩個(gè)基因進(jìn)行快速鑒定，加快了對(duì)分子標(biāo)記輔...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種番茄Ty?2基因和ty?5基因的多重PCR檢測方法，其特征在于，其包括以下步驟：1)從番茄葉中提取待檢測番茄葉片DNA；2)以上述番茄葉片提取獲得的DNA為模板，利用Ty?2和ty?5的引物，通過建立的多重PCR反應(yīng)體系，對(duì)待測樣品進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；3)PCR產(chǎn)物電泳檢測；4)對(duì)待測番茄樣品中是否含有Ty?2基因和ty?5基因進(jìn)行鑒定。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法，其特征在于，其包括以下步驟：
1)從番茄葉中提取待檢測番茄葉片DNA；
2)以上述番茄葉片提取獲得的DNA為模板，利用Ty-2和ty-5的引物，通過建立的多重
PCR反應(yīng)體系，對(duì)待測樣品進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；
3)PCR產(chǎn)物電泳檢測；
4)對(duì)待測番茄樣品中是否含有Ty-2基因和ty-5基因進(jìn)行鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重PCR檢測方法，其特征在于，步驟1)中的番茄葉取自育種、
野生、分離群體番茄品種的番茄葉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重PCR檢測方法，其特征在于，步驟2)中，Ty-2引物為：
T0302R：AGTGTACATCCTTGCCATTGACT
T0302F：TGGCTCATCCTGAAGCTGATAGCGC；
ty-5引物為：
ty5-17R：TAACAAAGCCCTCAAAGC
ty5-17F：GTCTCCGAAACGTAATCC。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重PCR檢測方法，其特征在于，步驟2)中，多重PCR反應(yīng)體系
為：
10ng/μL模板DNA2μL，
4pmmol/L的引物對(duì)T0302R/F與ty5-17R/F各0.5μL，
mix酶10μL，
雙蒸水或三蒸水加至20μL；
多重PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；每個(gè)循環(huán)95℃變性45s，54℃退火45s，72℃延伸
45s，共38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重PCR檢測方法，其特征在于，步驟3)電泳采用8％的聚丙烯
酰胺凝膠，電泳的具體步驟包括：
a)制備聚丙烯酰胺凝膠：KOH溶液浸泡玻璃板一定時(shí)間，用去污劑和清水清洗干凈，最
后用雙蒸水沖洗，晾干后用乙醇擦拭長短板；然后將長板處理面向上，短板處理面向下蓋到
長板上，用橡膠條固定兩個(gè)板，插入垂直電泳儀支架，...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王銀磊，趙統(tǒng)敏，余文貴，趙麗萍，楊瑪麗，姜靜，李亞茹，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32