本發(fā)明專利技術(shù)涉及組織工程和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種人工肝細(xì)胞微流體微囊制備方法及其該方法的專用設(shè)備—一種微流體微囊發(fā)生裝置。本發(fā)明專利技術(shù)利用海藻酸鈉與氯化鈣反應(yīng)生成海藻酸鈣水凝膠的化學(xué)原理，通過設(shè)計(jì)微流體裝置，借助連續(xù)相液體對(duì)分散相液體的剪切力、表面張力等作用形成大小穩(wěn)定的微囊。本發(fā)明專利技術(shù)制備得到的人工肝細(xì)胞微囊，能較長時(shí)間的維持囊內(nèi)種子細(xì)胞功能，在體外肝衰竭類似血漿影響下和體內(nèi)炎癥因素作用下依然能代謝有害物質(zhì)，保持一定的肝功能，有望應(yīng)用于生物人工肝系統(tǒng)和細(xì)胞治療。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及組織工程和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備
，特別涉及一種人工肝細(xì)胞微流體微囊制備方法及其―種微流體微囊發(fā)生裝置。
技術(shù)介紹
肝衰竭是常見的危重疾病，病情復(fù)雜，死亡率高。肝移植是治療肝衰竭較為有效的方法，但臨床上供體肝來源嚴(yán)重缺乏，很多患者在等待移植的過程中死亡。因此急需專利技術(shù)一種切實(shí)有效的生物人工肝支持系統(tǒng)，來暫代肝臟功能，給患者自身肝臟恢復(fù)創(chuàng)造一個(gè)良好的環(huán)境，或幫助患者順利過渡到移植手術(shù)期。生物人工肝支持系統(tǒng)中最核心的部分是種子細(xì)胞，該細(xì)胞能代替肝臟行使代謝、解毒、合成等功能，最理想的就是原代自體肝細(xì)胞，然而到肝病終末期，患者自體肝細(xì)胞狀態(tài)往往很差，難以勝任此工作。國內(nèi)外研究較多的種子細(xì)胞有原代豬肝細(xì)胞、功能改進(jìn)后的人肝癌細(xì)胞株、IPS類肝細(xì)胞和原代異體肝細(xì)胞等。常用的二維細(xì)胞培養(yǎng)模式很難維持這些細(xì)胞的功能。微囊化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是利用生物兼容性高分子材料形成微囊將細(xì)胞包裹在其中實(shí)現(xiàn)三維培養(yǎng)的一種技術(shù)，形成的微囊可以阻絕免疫細(xì)胞及大分子抗體進(jìn)入囊內(nèi)，同時(shí)允許氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和一些具有生物活性的小分子物質(zhì)自由出入，能較好的保護(hù)囊內(nèi)細(xì)胞維持細(xì)胞活性及功能。有學(xué)者將微囊化原代豬肝細(xì)胞應(yīng)用于生物人工肝研究，取得了一定的成效。然而，常用的依靠高速氣流(SugiuraS，OdaT，AoyagiY，eta1..Microfabricatedairflownozzleformicroencapsulationoflivingcellsinto150micrometermicrocapsules[J].BiomedMicrodevices，2007，9：91—99)、高壓靜電(WillaertRG,BaronGV.Gelentrapmentandmicro—encapsulation：methods,applicationsandengineeringprinciples[J].RevChemEng.,1996,12:185-205)等微囊發(fā)生裝置難以得到大小穩(wěn)定的微囊，且制作成本高，制作過程容易對(duì)細(xì)胞造成損傷。微流體技術(shù)是指采用微細(xì)加工技術(shù)制作出微通道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，或者將各種微細(xì)管道把實(shí)驗(yàn)室大型設(shè)備集成在盡可能小的操作平臺(tái)上，用以完成不同實(shí)驗(yàn)的技術(shù)。近些年來，該技術(shù)在化學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，它不僅使試劑的消耗降低，而且使實(shí)驗(yàn)速度提高，費(fèi)用降低，充分體現(xiàn)了當(dāng)今實(shí)驗(yàn)室設(shè)備微型化、集成化和便攜化的發(fā)展趨勢(林炳承,秦建華.微流控芯片分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)室[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào),2009,03:433-445)。因此，開發(fā)基于微流體的微囊發(fā)生裝置將簡化實(shí)驗(yàn)步驟，縮小實(shí)驗(yàn)設(shè)備，精確控制微囊大小，減小微囊制作過程對(duì)細(xì)胞造成傷害。海藻酸鈉凝膠因具有生物相容性好、細(xì)胞毒性較低、無免疫原性、可被生物降解、可以在適宜的條件下加工成形等優(yōu)點(diǎn)，正被廣泛應(yīng)用于制作生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的微囊，例如甲狀腺細(xì)胞、胰島細(xì)胞、肝細(xì)胞的包囊(PrakashS.Artificialcelltherapy：Newstrategiesforthetherapeuticdeliveryoflivebacteria[J].JournalofBiomedicineandBiotechnology,2005，44—56)。單純的海藻酸鈉微囊化肝細(xì)胞，較傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)模式能更好的維持肝細(xì)胞功能。但由于肝細(xì)胞生長的特殊性，例如貼壁生長、需要膠原支撐等，單純的海藻酸鈉微囊尚無法長時(shí)間維持其功能，離應(yīng)用于生物人工肝系統(tǒng)還有一段距離。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種人工肝細(xì)胞微流體微囊制備方法，本專利技術(shù)的另一目的在于提供一種人工肝細(xì)胞用微流體微囊發(fā)生裝置。本專利技術(shù)的主要技術(shù)方案包括，利用海藻酸鈉與氯化鈣反應(yīng)生成海藻酸鈣水凝膠的化學(xué)原理，通過設(shè)計(jì)微流體裝置，借助連續(xù)相液體(如豆油)對(duì)分散相液體(如海藻酸鈉與氯化鈣)的剪切力、表面張力等作用形成大小穩(wěn)定的微囊，并且在海藻酸鈉凝膠中加入了膠原和磁性物質(zhì)，讓其更適合種子細(xì)胞三維生長和應(yīng)用于生物人工肝支持系統(tǒng)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：本專利技術(shù)的第一方面，提供了一種微流體微囊發(fā)生裝置，包括上樣推進(jìn)組件、成囊組件、分離成膜組件；所述的上樣推進(jìn)組件，包括微量推注泵和三個(gè)注射器；所述的成囊組件，為連續(xù)的微流體通道；前端為微流體通道接入端，內(nèi)置一個(gè)連續(xù)相通道和兩個(gè)分散相通道；后端為中空的波形微流體通道；所述的分離成膜組件，依次包括油水分離器和旋轉(zhuǎn)成膜臺(tái)；所述的旋轉(zhuǎn)成膜臺(tái)由轉(zhuǎn)臺(tái)和至少六個(gè)收集管組成。所述的微流體通道，包括采用硅、或玻璃、或聚甲基丙烯酸甲酯、或聚二甲基硅氧烷微流體芯片經(jīng)微加工技術(shù)建立微流體通道網(wǎng)絡(luò)或選擇各種針頭、聚合物管、中空纖維等粘合而成。所述的一個(gè)連續(xù)相通道和兩個(gè)分散相通道分別與三個(gè)注射器相連；所述的波形微流體通道最后伸入油水分離器中；本專利技術(shù)的一種微流體微囊發(fā)生裝置，還包括移液管，用于將油水分離器中分離得到的微囊移至旋轉(zhuǎn)成膜臺(tái)。本專利技術(shù)的一種微流體微囊發(fā)生裝置，還包括網(wǎng)兜，用于盛接移液管移來的微囊，并放置于旋轉(zhuǎn)成膜臺(tái)的收集管中。本專利技術(shù)的一種微流體微囊發(fā)生裝置，所述的油水分離器底部設(shè)置一個(gè)磁場發(fā)生裝置。本專利技術(shù)的第二方面，提供了一種人工肝細(xì)胞微流體微囊制備方法，所述的方法包括以下步驟：A、海藻酸鈉混合溶液的制備：本步驟中的海藻酸鈉混合溶液，為海藻酸鈉混懸溶液未加種子細(xì)胞的溶液(即海藻酸鈉混合溶液加種子細(xì)胞后稱為海藻酸鈉混懸溶液)。用生理鹽水溶解海藻酸鈉配制1.5％-2.0％(質(zhì)量濃度)的海藻酸鈉溶液，混入磁性物質(zhì)，使磁性物質(zhì)在海藻酸鈉溶液中的比例為1-5mg/mL(重量體積比，W/V，優(yōu)選2mg/mL)，將此混合物用鈷60照射除菌；再以1：15-30(優(yōu)選1：26)的體積比加入Matrigel基質(zhì)膠，混合均勻，4℃冰箱保藏備用；B、微囊的制備分散相一，為種子細(xì)胞充分混勻于步驟A得到的海藻酸鈉混合溶液中得到分散相一(AS)；分散相二，氯化鈣(IS)，除菌；連續(xù)相，為不溶于水的油性介質(zhì)(OI)，如大豆油、甲基硅油等，除菌；將AS、IS、OI分別裝入注射器中，用微量推注泵推注入微流體通道中；在微流體通道中形成微囊后進(jìn)入油水分離器，待微囊表面形成一層鈣化的外膜后，進(jìn)行油水分離，并用生理鹽水洗滌；移至旋轉(zhuǎn)成膜臺(tái)，優(yōu)選的用網(wǎng)兜兜住微囊后，依次通過0.1％多聚賴氨酸溶液——生理鹽水——0.15％海藻酸鈉溶液——生理本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種人工肝細(xì)胞微流體微囊制備方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟：A、海藻酸鈉混合溶液的制備：用生理鹽水溶解海藻酸鈉配制1.5％?2.0％的海藻酸鈉溶液，混入磁性物質(zhì)，使磁性物質(zhì)在海藻酸鈉溶液中的重量體積比為1?5mg/mL，用鈷60照射除菌；再以1：15?30的體積比加入往上述溶液中加入膠原，混合均勻，4℃冰箱保藏備用；B、微囊的制備分散相一AS，為種子細(xì)胞充分混勻于步驟A得到的海藻酸鈉混合溶液中得到分散相一；分散相二IS，1％?3％的氯化鈣溶液，除菌；連續(xù)相OI，不溶于水的油性介質(zhì)，除菌；將AS、IS、OI分別裝入注射器中，用微量推注泵推注入微流體通道中；在微流體通道中形成初級(jí)微囊后進(jìn)入油水分離器，待微囊表面形成一層鈣化的外膜后，進(jìn)行油水分離，并用生理鹽水洗滌；移至旋轉(zhuǎn)成膜臺(tái)，依次通過0.1％多聚賴氨酸溶液、生理鹽水、0.15％海藻酸鈉溶液、生理鹽水、55mmol/L的檸檬酸鈉溶液、生理鹽水，得到最終的微囊。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種人工肝細(xì)胞微流體微囊制備方法，其特征在于，所述的方法包括以
下步驟：
A、海藻酸鈉混合溶液的制備：
用生理鹽水溶解海藻酸鈉配制1.5％-2.0％的海藻酸鈉溶液，混入磁性物
質(zhì)，使磁性物質(zhì)在海藻酸鈉溶液中的重量體積比為1-5mg/mL，用鈷60照
射除菌；
再以1：15-30的體積比加入往上述溶液中加入膠原，混合均勻，4℃
冰箱保藏備用；
B、微囊的制備
分散相一AS，為種子細(xì)胞充分混勻于步驟A得到的海藻酸鈉混合溶液
中得到分散相一；
分散相二IS，1％-3％的氯化鈣溶液，除菌；
連續(xù)相OI，不溶于水的油性介質(zhì)，除菌；
將AS、IS、OI分別裝入注射器中，用微量推注泵推注入微流體通道中；
在微流體通道中形成初級(jí)微囊后進(jìn)入油水分離器，待微囊表面形成一
層鈣化的外膜后，進(jìn)行油水分離，并用生理鹽水洗滌；
移至旋轉(zhuǎn)成膜臺(tái)，依次通過0.1％多聚賴氨酸溶液、生理鹽水、0.15％
海藻酸鈉溶液、生理鹽水、55mmol/L的檸檬酸鈉溶液、生理鹽水，得到最
終的微囊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人工肝細(xì)胞微流體微囊制備方法，其特征在
于，所述的種子細(xì)胞為原代豬肝細(xì)胞、原代人肝細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞株、IPS
類肝細(xì)胞、原代異體肝細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人工肝細(xì)胞微流體微囊制備方法，其特征在
于，該方法還包括步驟C、將步驟B獲得的微囊置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱
中孵育。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種人工肝細(xì)胞微流體微囊制備方法，
其特征在于，步驟B中的油水分離中，在油水分離器底部添加一個(gè)0.5-1T
的磁場。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種人工肝細(xì)胞微流體微囊制備方法，
\t其特征在于，步驟B得到的最終的微囊，粒徑為50--500μm。
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：吳紅平，金曉芳，唐為忠，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海賽立維生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31
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