可吸附蜂毒肽的水凝膠納米顆粒的制備方法及其親和性的檢測方法技術

本發明專利技術公開了一種可吸附蜂毒肽的水凝膠納米顆粒的制備方法及其親和性的檢測方法。所述制備方法為：將N，N-二乙基丙烯酰胺和丙烯酸單體、交聯劑及乳化劑按比例用去離子水溶解于容器中，并在室溫下鼓入氮氣除氧，磁力攪拌，反應溫度升至60-80℃，保溫20min-60min并且保持氮氣氣氛，加入引發劑引發聚合反應，透析，即得水凝膠納米顆粒溶液。檢測方法為：采用溶血性試驗檢測水凝膠納米顆粒與蜂毒肽之間的親和性。本發明專利技術采用的合成均在水相中完成，使用的單體和助劑均為常見試劑，綠色環保且容易實現，使這種NPs具有廉價易得的優點制得的水凝膠納米顆粒對蜂毒肽有明顯的吸附效果。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物醫藥材料制備領域，具體涉及一種可吸附蜂毒肽的水凝膠納米顆粒的制備方法及其與蜂毒肽之間親和性的檢測方法。
技術介紹
水凝膠納米顆粒(nanoparticleshydrogels，NPs)含水量高，類似于生物組織，有良好的生物相容性。納米水凝膠內部可以負載具有生物活性的組分，并且對外界刺激如溫度、pH值、光等產生響應會發生體積、折光系數、凝膠網絡通透性等變化。人們致力于制備各種各樣的NPs，其與生物分子如多肽、蛋白質親和吸附作用制成穩定性好、可靠且可大規模生產的、達到取代抗體的目的的研究，并且這種NPs廉價易得，在生物納米
引起了廣泛的關注。生物大分子間(如蛋白質-蛋白質)的相互作用有靜電作用、親水/疏水作用以及在三維立體結構界面上互補的范德華力。而一般這種NPs的構建則也可具備多種官能團，通過靜電作用、氫鍵作用、三維立體結構界面上互補的范德華力，或者親水/疏水作用識別復雜如蛋白質、多肽或碳水化合物等生物靶標。可以通過調控和優化共聚反應的單體組成和比例，從而達到這種納米顆粒的構建。特別地，這種NPs可以捕獲毒素分子，并且可以在活體中進行毒素中和，有“塑料抗體(plasticantibody)”之稱。與小分子解毒劑相比，這種由NPs制成的“塑料抗體”通過多位點相互作用，與目標物生物大分子表面接觸的區域更大，從而更有效地中和目標毒素的毒性。并且，NPs尺寸足夠小，幾乎能達到體內的各個地方，比如毛細血管、器官，甚至體內細胞。蜂毒肽(蜂毒肽)又稱溶血肽，是一種典型的陽離子多肽，由26個氨基酸殘基組成，分子量為2840，是蜂毒中最主要的活性成分，約占蜂毒干重的50％。蜂毒肽能夠在各種腫瘤細胞中誘導細胞周期阻滯、增長抑制、凋亡和壞死。它對人類肝細胞瘤和神經膠質瘤細胞系產生明顯的生長抑制和細胞毒性。它具有兩性分子屬性，通過造成缺陷、破壞或氣孔形成，擾亂細胞膜雙分子層的完整性。由此產生脂質雙分子層的開放將導致跨膜電化學梯度的崩潰。所以這個特性決定蜂毒肽既可以溶于水中，又可以與膜自然結合，進而可溶解細胞，具有強溶血作用或肥大細胞的脫顆粒作用，它的溶血性能是一個有效的定量評價手段。加州大學的Shea課題組[YuH，LeeSH，KanazawaH，etal.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences，2012，109(1)：33-38.]基于N-叔丁基丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺和丙烯酸三種單體合成的NPs人工合成了蜂毒肽的抗體，并且將其運用于老鼠的活體試驗中，獲得良好的效果。但目前本專利技術中涉及到的一種可吸附蜂毒肽的水凝膠納米顆粒的制備及親和性檢測方法尚未見文獻報道。
技術實現思路
本專利技術所要解決的問題是提供一種可吸附蜂毒肽的水凝膠納米顆粒的制備及親和性檢測方法。為了解決上述問題，本專利技術提供了一種可吸附蜂毒肽的水凝膠納米顆粒的制備方法，其特征在于，將N，N-二乙基丙烯酰胺(DEA)和丙烯酸(AAc)單體、交聯劑及乳化劑按比例用去離子水溶解于容器中，并在室溫下鼓入氮氣除氧，磁力攪拌，反應溫度升至60-80℃，保溫20min-60min并且保持氮氣氣氛，加入引發劑引發聚合反應3-6h，透析，即得水凝膠納米顆粒溶液。優選地，所述交聯劑為N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺；其添加量為單體質量總和的1％-15％。優選地，所述乳化劑為十二烷基硫酸鈉；其添加量為單體質量總和的1％-7％。優選地，所述引發劑為過硫酸銨；其添加量為單體質量總和的0.1％-3％。優選地，所述透析步驟具體為：采用去離子水浸泡3-7天，每天換一次水。進一步地，所用透析袋的截留分子量為8000-14000。本專利技術提供了上述可吸附蜂毒肽的水凝膠納米顆粒親和性的檢測方法，其特征在于，配制4％-10％的血紅細胞溶液，取100μL將其與70μL的水凝膠納米顆粒、10μL的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)及20μL的蜂毒肽溶液在離心管中混合，于37℃下保溫30min；然后，將其在37℃離心5min，將100μL上清液轉移至新的離心管中，用UV-Vis表征上清液吸光度的變化；測定紅細胞100％溶血和紅細胞在緩沖液中自發溶血的兩組吸光度值，中和溶血百分數即可直觀地反應蜂毒肽對紅細胞的溶血作用，從而判斷納米顆粒對蜂毒肽的吸附作用。若納米顆粒對蜂毒肽有吸附效果，則保護了紅細胞阻止其發生溶血。其中，中和溶血百分數＝(樣品吸光度-陰性對照組吸光度)/(陽性對照組吸光度-陽性對照組吸光度)×100％。優選地，所述血紅細胞為牛血紅細胞。優選地，所述磷酸鹽緩沖溶液濃度為0.01M-0.1M。優選地，所述蜂毒肽溶液濃度為5-50μM。優選地，所述離心時的離心力為1000-10000g。本專利技術以N，N-二乙基丙烯酰胺(DEA)、丙烯酸(AAc)為單體共聚，合成溫敏性的聚合物納米顆粒對蜂毒肽進行控制和釋放，采用溶血性試驗檢測NPs與蜂毒肽之間的親和性。本專利技術的有益效果在于：(1)本專利技術采用的合成均在水相中完成，使用的單體和助劑均為常見試劑，綠色環保且容易實現，使這種NPs具有廉價易得的優點。(2)本專利技術的NPs對蜂毒肽有明顯的吸附效果，NPs與蜂毒肽之間有親和力。這種NPs穩定性好、可靠且可大規模生產，有望達到取代抗體的目的。附圖說明圖1為不同單體比例的P(DEA/AAc)水凝膠納米顆粒對蜂毒肽的吸附效果(DEA∶AAc，wt％：(a)90％/10％(b)80％/20％(c)70％/30％(d)60％/40％)具體實施方式為使本專利技術更明顯易懂，茲以優選實施例，并配合附圖作詳細說明如下。實施例1(1)水凝膠納米顆粒的制備：取0.45gDEA、0.05gAAc、0.025g交聯劑N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺、0.025g乳化劑十二烷基硫酸鈉溶于50mL超純水中，并在室溫下鼓入氮氣除氧，磁力攪拌，反應溫度升至70℃，保溫30min并且保持氮氣氣氛，加入0.0025g引發劑過硫酸銨，繼續反應4h。然后把所得反應物浸泡于超純水中透析7天，每天換一次水，去除殘留反應原料及反應體系中的電解質，即得。(2)水凝膠納米顆粒吸附蜂毒肽的溶血性中和試驗：配制6％的血紅細胞溶液，取100μL將其與70μL的NPs(其中NPs的濃度調為五組分別為5，10，50，100，500μg/mL，NPs的單體比例DEA∶AAc為90％/10％，wt％)、10μL的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，0.本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種可吸附蜂毒肽的水凝膠納米顆粒的制備方法，其特征在于，將N，N?二乙基丙烯酰胺和丙烯酸單體、交聯劑及乳化劑按比例用去離子水溶解于容器中，并在室溫下鼓入氮氣除氧，磁力攪拌，反應溫度升至60?80℃，保溫20min?60min并且保持氮氣氣氛，加入引發劑引發聚合反應3?6h，透析，即得水凝膠納米顆粒溶液。

【技術特征摘要】
1.一種可吸附蜂毒肽的水凝膠納米顆粒的制備方法，其特征在于，將N，N-二乙
基丙烯酰胺和丙烯酸單體、交聯劑及乳化劑按比例用去離子水溶解于容器中，并
在室溫下鼓入氮氣除氧，磁力攪拌，反應溫度升至60-80℃，保溫20min-60min
并且保持氮氣氣氛，加入引發劑引發聚合反應3-6h，透析，即得水凝膠納米顆粒
溶液。
2.如權利要求1所述的可吸附蜂毒肽的水凝膠納米顆粒的制備方法，其特征在
于，所述交聯劑為N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺；其添加量為單體質量總和的
1％-15％。
3.如權利要求1所述的可吸附蜂毒肽的水凝膠納米顆粒的制備方法，其特征在
于，所述乳化劑為十二烷基硫酸鈉；其添加量為單體質量總和的1％-7％。
4.如權利要求1所述的可吸附蜂毒肽的水凝膠納米顆粒的制備方法，其特征在
于，所述引發劑為過硫酸銨；其添加量為單體質量總和的0.1％-3％。
5.如權利要求1所述的可吸附蜂毒肽的水凝膠納米顆粒的制備方法，其特征在
于，所述透析步驟具體為：采用去離子水浸泡3-7天，每天換一次水。
6.如權利要求5所述的可吸附蜂毒肽的水凝膠納米顆粒的制備方法，其特征在
于，所用透析袋的截留分子量為8000-14000。
7.一種權利要求1-6任意一項所述的可吸附蜂毒肽的水凝膠納米顆粒親和性...

【專利技術屬性】
技術研發人員：魯希華，李雪婷，
申請(專利權)人：東華大學，
類型：發明
國別省市：上海;31