與靶蛋白質(zhì)結(jié)合的核酸片段制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)的目的是開發(fā)并提供用于有效制備核酸適體、特別是DNA適體的方法，所述核酸適體相比通過常規(guī)方法獲得的核酸適體具有對(duì)靶物質(zhì)的更高的特異性和結(jié)合活性。本發(fā)明專利技術(shù)提供了包含天然核苷酸和具有人工堿基可配對(duì)的人工堿基的非天然核苷酸的可轉(zhuǎn)錄或可復(fù)制的核酸適體。本發(fā)明專利技術(shù)還提供了用于對(duì)選自單鏈核酸文庫(kù)的含有非天然核苷酸的單鏈核酸分子進(jìn)行測(cè)序的方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
與靶蛋白質(zhì)結(jié)合的核酸片段本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2012年11月15日，申請(qǐng)?zhí)枮?01280067396.0，專利技術(shù)名稱為“與靶蛋白質(zhì)結(jié)合的核酸片段”的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
本專利技術(shù)涉及用于使用包含人工堿基(artificialbase)的核酸文庫(kù)有效制備功能性核酸、特別是核酸適體(尤其是，DNA適體)的方法。
技術(shù)介紹
近年來，核酸適體，如與其它功能性核酸諸如siRNA一樣，作為代替低分子量化合物用于制藥藥物或診斷藥物的新的活性成分已受到關(guān)注，并且在世界各地以多種方式被研究和開發(fā)，旨在在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用適體。這些核酸適體是能夠通過其自身的構(gòu)象牢固地并且特異地與靶物質(zhì)諸如蛋白質(zhì)結(jié)合以抑制或壓制靶物質(zhì)的功能的功能性核酸。在2004年被FDA批準(zhǔn)的用于治療年齡相關(guān)性黃斑變性(age-relatedmaculardegeneration)的靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的修飾的RNA適體(Macugen)已知為藥學(xué)上使用的核酸適體的典型實(shí)例。相比作為包括20種氨基酸的蛋白質(zhì)的抗體，此類核酸適體僅由4種堿基構(gòu)成。此外，這4種堿基在化學(xué)或物理性質(zhì)方面十分類似。由于這些原因，核酸適體被變化形式(variation)和性能不利地限制。為了解決這個(gè)問題，以前報(bào)道的方法在核酸文庫(kù)中使用一種或兩種類型的修飾的天然堿基用于核酸適體分離，所述修飾的天然堿基包括通過接頭(linker)與取代基結(jié)合的天然堿基(專利文獻(xiàn)1和2以及非專利文獻(xiàn)1至3)。預(yù)期用于應(yīng)用至能夠檢測(cè)蛋白質(zhì)的核酸芯片并且可被用于診斷領(lǐng)域的DNA適體也被已知為包括此類修飾的天然堿基的修飾的核酸適體(非專利文獻(xiàn)3)。然而，被引入修飾的核酸適體的一種或兩種類型的修飾的天然堿基導(dǎo)致具有修飾的天然堿基的整個(gè)核酸適體中約25％或更多的堿基的替換。雖然提高了適體的生產(chǎn)效率，但這提出了適體的減少的選擇性或細(xì)胞毒性的另一個(gè)問題。因此，使用具有修飾的天然堿基的修飾的核酸適體目前限于診斷，且沒有這樣的適體被批準(zhǔn)用作治療藥物(非專利文獻(xiàn)3)。引用列表專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1：日本專利公布(Kohyo)號(hào)09-502354A(1997)專利文獻(xiàn)2：WO1992014842非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1：ShojiA.,等人,J.Am.Chem.Soc.,129,1456-1464(2007)非專利文獻(xiàn)2：VaughtJ.D.,等人,J.Am.Chem.Soc.,132,4141-4151(2010)非專利文獻(xiàn)3：GoldL.,等人,PLoSOne,5,e15004(2010)
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
技術(shù)問題本專利技術(shù)的一個(gè)目的是開發(fā)并提供用于有效制備核酸適體、特別是DNA適體的方法，所述核酸適體相比通過常規(guī)方法獲得的核酸適體具有針對(duì)靶物質(zhì)的更高的特異性和結(jié)合活性。本專利技術(shù)的另一個(gè)目的是提供包括核酸分子作為活性成分的藥物組合物。問題的解決方案本專利技術(shù)人進(jìn)行了勤勉的研究以實(shí)現(xiàn)目的，并因此發(fā)現(xiàn)了可通過將具有人工堿基的非天然核苷酸引入由天然核苷酸組成的單鏈核酸分子，獲得相比僅由天然核苷酸構(gòu)成的核酸適體具有更高的靶物質(zhì)結(jié)合能力的核酸適體。該人工堿基與另一個(gè)人工堿基通過互補(bǔ)是可配對(duì)的，并因此也可以在核酸復(fù)制或轉(zhuǎn)錄方面行使功能。這允許通過常規(guī)核酸擴(kuò)增方法例如PCR擴(kuò)增核酸文庫(kù)。雖然能夠在核酸復(fù)制或轉(zhuǎn)錄方面行使功能的此人工堿基已經(jīng)是已知的(HiraoI.,等人,NatureMethods,3,729-735(2006)；HiraoI.,等人,J.Am.Chem.Soc.,129,15549-15555(2007)；KimotoM.,等人,NucleicAcidsRes.,37,e14(2009)；KimotoM.,等人,J.Am.Chem.Soc.,132,15418-15426(2010)；KimotoM.,等人,ExpertRev.Mol.Diagn.,11,321-331(2011)；MalyshevD.A.,等人,J.Am.Chem.Soc.,131,14620-14621(2009)；MalyshevD.A.,等人,Chemistry,16,12650-12659(2010)；YangZ.,等人,NucleicAcidsRes.,35,4238-4249,(2007)；和YangZ.,等人,J.Am.Chem.Soc.,133,15105-15112(2011))，到目前為止，包括具有人工堿基的非天然核苷酸的核酸適體是完全未知的。這部分地是因?yàn)闆]有已經(jīng)建立的用于對(duì)核酸文庫(kù)中包括非天然核苷酸的核酸適體進(jìn)行測(cè)序的方法。因此，本專利技術(shù)人還開發(fā)了用于確定包括包含非天然核苷酸的核酸分子的文庫(kù)中單個(gè)核苷酸序列的新的方法。本專利技術(shù)基于開發(fā)結(jié)果，并特別地提供了以下方面：(1)一種可轉(zhuǎn)錄或可復(fù)制的核酸適體，其包括天然核苷酸以及具有人工堿基可配對(duì)的人工堿基(artificialbase-pairableartificialbase)的非天然核苷酸。(2)根據(jù)(1)的核酸適體，其中人工堿基選自由Ds、Pn、和Pa構(gòu)成的組。(3)根據(jù)(2)的核酸適體，其中人工堿基包括人工堿基的人工堿基可配對(duì)衍生物(artificialbase-pairablederivativeofartificialbase)。(4)根據(jù)(1)至(3)中任一項(xiàng)的核酸適體，其中非天然核苷酸的含量為核苷酸總數(shù)的20％或更少。(5)根據(jù)(1)至(4)中任一項(xiàng)的核酸適體，其中核酸是DNA或RNA。(6)根據(jù)(1)的核酸適體，其中核酸適體針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子作為靶物質(zhì)。(7)根據(jù)(6)的核酸適體，其中核酸適體包括選自由以下構(gòu)成的組的任何一個(gè)核苷酸序列：SEQIDNO：25至73、80至104、106至109、111、和155至166(只要序列中的“n”表示Ds)、175、177、179、181、183、198、201、202、205至209、211、212、和229至278。(8)根據(jù)(7)的核酸適體，其中核酸適體由5'側(cè)翼為SEQIDNO:1表示的核苷酸序列且3'側(cè)翼為SEQIDNO:2表示的核苷酸序列的根據(jù)(7)的任何一個(gè)核苷酸序列組成。(9)根據(jù)(1)的核酸適體，其中核酸適體針對(duì)干擾素γ作為靶物質(zhì)。(10)根據(jù)(9)的核酸適體，其中核酸適體包括選自由以下構(gòu)成的組的任何一個(gè)核苷酸序列：SEQIDNO：167至174(只要序列中的“n”表示Ds)、186、188、190、192、194、214至222、和279至328。(11)根據(jù)(10)的核酸適體，其中核酸適體由5'側(cè)翼為SEQIDNO:1表示的核苷酸序列且3'側(cè)翼為SEQIDNO:2表示的核苷酸序列的根據(jù)(10)的任何一個(gè)核苷酸序列組成。(12)一種單鏈核酸文庫(kù)，所述單鏈核酸文庫(kù)包括可轉(zhuǎn)錄或可復(fù)制的、含有非天然核苷酸的單鏈核酸分子，所述含有非天然核苷酸的單鏈核酸分子包括天然核苷酸和具有人工堿基可配對(duì)的人工堿基的非天然核苷酸。(13)根據(jù)(12)的單鏈核酸文庫(kù)，其中非天然核苷酸在含有非天然核苷酸的單鏈核酸分子中的含量為核苷酸總數(shù)的20％或更少。(14)根據(jù)(12)或(13)的單鏈核酸文庫(kù)，其中單鏈核酸分子包括5'-末端和3'-末端的引物結(jié)合區(qū)，以及位于引物結(jié)合區(qū)之間的中心區(qū)(centralregion)，所述引物結(jié)合區(qū)各自由文庫(kù)中共有的已知核本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種可轉(zhuǎn)錄或可復(fù)制的核酸適體，所述核酸適體包含天然核苷酸和具有人工堿基可配對(duì)的人工堿基的非天然核苷酸，其中所述核酸適體針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子作為靶物質(zhì)。

【技術(shù)特征摘要】
2011.11.18 JP 2011-253357;2012.07.02 JP 2012-148961.一種可轉(zhuǎn)錄或可復(fù)制的核酸適體，所述核酸適體包含天然核苷酸和具有人工堿基可配對(duì)的人工堿基的非天然核苷酸，其中所述核酸適體針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子作為靶物質(zhì)；其中所述核酸適體包括選自由以下構(gòu)成的組的任何一個(gè)核苷酸序列：SEQIDNO：25至73；SEQIDNO：80至104；SEQIDNO：106至109；SEQIDNO：111；SEQIDNO：155至166，條件是序列SEQIDN...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：平尾一郎，平尾路子，山重里恵，橫山茂之，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：塔古西庫(kù)斯生物株式會(huì)社，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：日本;JP