本發明專利技術公開了一種谷氨酸脫羧酶突變體及其制備方法和用途，該突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發明專利技術還公開了一種包含編碼谷氨酸脫羧酶突變體基因的表達單元、重組質粒和轉化子。本發明專利技術根據與嗜熱古細菌(Thermococcus?kodakarensis)GAD氨基酸序列的比對信息，采用定點突變的方法在短乳桿菌GAD對應的氨基酸位點引入脯氨酸殘基，通過理性設計提高GAD的熱穩定性，該突變酶在催化L-谷氨酸或其鈉鹽生成γ-氨基丁酸的過程中具有更好的熱穩定性，有利于GABA的工業化生產。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分子生物學
，具體涉及一種谷氨酸脫羧酶突變體及其制備方 法和用途。
技術介紹
谷氨酸脫駿酶(glutamatedecarboxylase，簡稱GAD;E(^4.1 · 1 · 15)以磷酸吡咳酸 (PLP)為輔酶，能專一1性地催化L-谷氨酸脫羧合成γ-氨基丁酸（γ-aminobutyrate，GABA) 的酶。GABA廣泛存在于動物、植物和微生物中，是一種天然存在的非蛋白質氨基酸，在哺乳 動物中樞神經系統中具有抑制過度興奮、解除神經緊張等生理功能。此外，GABA具有預防血 管硬化、延緩衰老、修復皮膚、降血壓、鎮靜安神、改善睡眠和記憶力等多種重要的生理功 能，被廣泛應用于醫藥衛生、功能食品和動物飼料等行業。2009年，我國衛生部正式批準 GABA為"新資源食品"。在工業生產過程中，良好的熱穩定性是理想的生物催化劑所應具備的特征之一。 工業生物催化過程中酶不僅處于不斷"消耗"的過程，而且操作過程中會有針對性地采用更 高的溫度，以提高反應速率，增加底物溶解度，降低體系粘度等，因此對酶的熱穩定性提出 了更高的要求。細菌中GAD酶在50°C以上極易失活，這嚴重制約GAD在工業生產中的應用。 本課題組前期篩選到一種生產γ-氨基丁酸的短乳桿菌(Lactobacillusbrevis) CGMCCNO. 1306，對該菌株的GAD基因進行克隆，構建重組質粒pET28a( + )-GAD1407，轉化到 大腸桿菌BL21(DE3)中，實現了可溶性表達（申請號201010567447.9的專利文獻）。但是，實 驗表明谷氨酸脫羧酶在55°C下的半衰期僅為30.9min，非常不利于GAD在GABA生物制備中的 應用，其耐熱性穩定性有待進一步提尚。 定點突變(site-directedmutagenesis)是指通過聚合酶鏈式反應(PCR)等方法 向目的DNA片段(基因組或質粒）中引入特定堿基對的技術(包括堿基的添加、刪除、點突變 等），通過改變基因特定位點核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列，可迅速、高效的提高 DNA所表達目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段。大量研究表明，蛋白質分子中引入脯氨酸(Prolinetheory)可以降低蛋白質去折 疊的骨架熵，增加蛋白質的剛性，顯著提高蛋白質的熱穩定性。但是蛋白質的熱穩定性受諸 多因素的影響，因此并非所有的脯氨酸替換都能提高蛋白質的熱穩定性，只有在合適的位 點進行脯氨酸替換才能真正改善其熱穩定性。 公告號為CN103031322B的專利文獻公開了一種谷氨酸脫羧酶熱穩定變體G311P 基因，其核苷酸序列在第311位有定點突變。公告號為CN103031323B的專利文獻公開了一 種谷氨酸脫羧酶熱穩定變體G56P基因，其核苷酸序列在第56位有定點突變。研究發現，此位 點突變后得到的變體基因編碼的谷氨酸脫羧酶的熱穩定性有所增強。通過在編碼野生GAD 酶基因基礎上進行定點突變，提高了其對應變體酶在在60°C和70°C下的熱穩定性。隨著酶 熱穩定性的提高，在工業生產過程中可以采用更高的操作溫度，以提高反應速率、增加底物 溶解度，有利于利用該酶通過生物轉化生產GABA。 Haruyuki Atomi等（Journal of Bacteriology，2014,196)報道嗜熱古細菌 Thermococcus kodakarensis GAD的最適反應溫度達到80°C，該酶在80°C和90°C的半衰期 分別為l〇h和5.5h。應用同源比對策略，對熱穩定性差的野生型蛋白質進行改造將是提高蛋 白質熱穩定性的有效手段。
技術實現思路
本專利技術根據與嗜熱古細菌(Thermococcus kodakarensis)GAD氨基酸序列的比對 信息，采用定點突變的方法在短乳桿菌GAD對應的氨基酸位點引入脯氨酸殘基，通過理性設 計提高GAD的熱穩定性，獲得的突變體比野生型GAD具有更好的熱穩定性，提高了GAD在工業 上的應用價值。 一種谷氨酸脫羧酶突變體，氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。 本專利技術研究的基礎是來自短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)CGMCCNO.1306的 GAD1407基因。本專利技術提供的谷氨酸脫羧酶突變體氨基酸序列的第364位由甘氨酸G突變為 脯氨酸P，該突變體(G364P)的半失活溫度(T5Q15)為61.6°C，比野生型酶提高2.5°C;在55°C 下的半衰期(ti/2)為45.4min，比野生型酶延長14.5min。 本專利技術提供了編碼所述谷氨酸脫羧酶突變體的基因。本專利技術將編碼野生型谷氨酸 脫羧酶第364位甘氨酸的密碼子GGG替換為編碼脯氨酸的CCG，該突變體的核苷酸序列如SEQ IDNO. 1所示。本專利技術還提供了包含所述基因的表達單元、重組質粒和轉化子。 作為優選，所述表達單元的啟動子為T7啟動子、lac啟動子或araBAD啟動子。在這 些啟動子的作用下，谷氨酸脫羧酶的突變酶可以直接在大腸桿菌宿主細胞中實現胞內可溶 表達。作為優選，所述重組質粒的原始載體為質粒pET28a( + )。作為優選，所述轉化子的宿主細胞為大腸桿菌細胞。本專利技術還提供了一種谷氨酸脫羧酶突變體的制備方法，包括以下步驟： (1)將來自嗜熱古細菌(Thermococcuskodakarensis)的谷氨酸脫羧酶的氨基酸 序列與野生型谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列進行比對，選擇來自嗜熱古細菌(Thermococcus kodakarensis)的谷氨酸脫羧酶中脯氨酸所對應的野生型谷氨酸脫羧酶氨基酸位點為突變 位點； (2)針對所述突變位點替換為脯氨酸設計定點突變引物，以野生型谷氨酸脫羧酶 基因為模板，進行PCR擴增，擴增產物轉化至宿主細胞，表達獲得定點突變體； (3)從所有突變體中篩選獲得熱穩定性最高的酶突變體。該方法可有效增加突變成功的概率，降低篩選工作量，提高實驗效率。采用該方法 獲得的突變體比野生型GAD具有更好的熱穩定性，從而證明了本專利技術通過同源比對策略選 擇突變位點的篩選方案是可行的。作為優選，所述野生型谷氨酸脫羧酶分離自短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)。 本專利技術對短乳桿菌GAD氨基酸序列與嗜熱古細菌(Thermococcuskodakarensis) GAD氨基酸序列對比，引入脯氨酸的突變位點分別為M70、K89、S162、A224、A242、A261、G277、 ￥284、￥306、￥323、6364、6372^427，采用?〇?定點突變的方法對上述位點進行突變，獲得突 變酶。通過測定半失活溫度(T5Q15)和半衰期(t1/2)對突變酶的熱穩定性進行表征，最終獲得 一種GAD熱穩定性提高的突變體(G364P)。作為優選，制備核苷酸序列如SEQIDNO. 1的GAD突變體的定點突變引物為： G364P-F:5 '-ATCGCTCACTAAATTACCGGGCTTTTCCCTCATTAAT-3 '； G364P-R:5 '-TAATGAGGGAAAAGCCCGGTAATTTAGTGAGCGATTTC-3 '。本專利技術還提供了所述谷氨酸脫羧酶突變體在催化L-谷氨酸或其鈉鹽生成γ-氨基 丁酸中的應用。 本專利技術具備的有益效果:本本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種谷氨酸脫羧酶突變體，其特征在于，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：胡升，黃俊，方文姬，梅樂和，趙偉睿，呂常江，
申請(專利權)人：浙江大學寧波理工學院，
類型：發明
國別省市：浙江;33
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