一種鴨肝炎病毒瓊擴抗原及其制備方法與應用技術

本發(fā)明專利技術提供了一種鴨肝炎病毒瓊擴抗原及其制備方法與應用，所述瓊擴抗原是將鴨肝炎病毒接種大量麻鴨胚進行培養(yǎng)增殖，收集胚尿囊液，通過低溫超速離心進行病毒的濃縮，并通過蔗糖梯度離心及超速離心進行病毒純化獲得的鴨肝炎病毒瓊擴抗原；通過條件優(yōu)化，確定了最佳抗原和抗體反應濃度，通過特異性試驗、重復性試驗和靈敏性試驗證實該方法簡單可行，本發(fā)明專利技術利用所述瓊擴抗原建立的鴨肝炎病毒抗體檢測方法具有特異性強、穩(wěn)定性好、敏感性高等特點，為鴨肝炎病毒抗體提供了簡單、特異、靈敏、成本低廉和實用的檢測方法。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術設及獸醫(yī)診斷
，尤其是一種鴨肝炎病毒瓊擴抗原及其制備方法與 應用。
技術介紹
鴨病毒性肝炎（Duck virus hepatitis，DVH)是由鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV)引起維鴨的一種傳播迅速和高度致死性傳染病，W肝臟呈現(xiàn)出血性炎癥為特征 的急性烈性傳染病。主要特征為肝臟腫大，有出血斑點和神經(jīng)癥狀。在新疫區(qū)，本病的死亡 率很高，可達90 % W上。1945年在美國首次發(fā)現(xiàn)本病，并命名為I型鴨病毒性肝炎。 目前，對鴨病毒性肝炎的預防和控制主要W滅活疫苗、雞胚弱毒疫苗、高免血清和 高免蛋黃抗體為主，而免疫效果的監(jiān)測主要是通過中和試驗測定中和抗體效價來進行。中 和試驗操作繁瑣、周期長、且對試驗條件和技術的要求較高，一般基層獸醫(yī)診斷站無法進行 檢測。 針對養(yǎng)殖場及基層獸醫(yī)檢疫部口技術欠缺及設備簡單的現(xiàn)狀，W及鴨病毒性肝炎 血清抗體和蛋黃抗體等產(chǎn)品效價檢測及免疫效果評價的需要，十分必要且緊迫需要創(chuàng)建一 種簡單實用有效的鴨病毒性肝炎抗體檢測方法。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術所要解決的技術問題在于提供一種鴨肝炎病毒瓊擴抗原。 本專利技術所要解決的另一技術問題在于提供上述鴨肝炎病毒瓊擴抗原的制備方法。 本專利技術所要解決的另一技術問題在于提供上述鴨肝炎病毒瓊擴抗原的應用。[000引為解決上述技術問題，本專利技術的技術方案是： -種鴨肝炎病毒瓊擴抗原，是由下述方法得到的： (1)病毒繁殖:將第5代I型和第8代虹型鴨肝炎病毒接種10日齡非免疫麻鴨胚，收 獲72小時至96小時內(nèi)死亡鴨胚尿囊液，放于4°C保存； (2)病毒滅活:將收集的尿囊液經(jīng)終濃度2%〇甲醒混合混勻，于37°C搖床內(nèi)滅活24 小時； (3)病毒濃縮:將滅活好的尿囊液于4°C、800化/min離屯、45min，取上清，再于4°C、 4500化/min離屯、化，棄上清后沉淀用滅菌生理鹽水重懸，得到病毒濃縮液，儲存于-70°C; (4)病毒純化:制備10%、20%、30%、40%和50%5個梯度的薦糖平衡液，化0%薦 糖液上加上病毒濃縮液，于4°C、40000r/min水平離屯、化后，收集病毒帶，于4°C、45000r/min 離屯、化后，棄上清后沉淀用滅菌生理鹽水重懸，用RT-PCR的方法檢測各帶的病毒含量，W 40 %帶病毒含量最大，作為為瓊擴抗原，儲存于-70°C，即得。優(yōu)選的，上述鴨肝炎病毒瓊擴抗原，所述步驟（1)中將第5代I型和第8代虹型鴨肝 炎病毒接種10日齡非免疫麻鴨胚，0.1ml/枚，于38°C解化箱解育，棄去24小時內(nèi)接種死亡的 鴨胚，收集72小時至96小時內(nèi)死亡鴨胚，4°C靜置6-8小時，收集尿囊液，放于4°C保存。 優(yōu)選的，上述鴨肝炎病毒瓊擴抗原，所述步驟(4)中使用20mL超速離屯、管，超速離 屯、管中每個梯度的薦糖平衡液3ml，在10%薦糖液上加病毒濃縮液3ml。 上述鴨肝炎病毒瓊擴抗原的制備方法，具體步驟如下： (1)病毒繁殖:將第5代I型和第8代虹型鴨肝炎病毒接種10日齡非免疫麻鴨胚，收 獲72小時至96小時內(nèi)死亡鴨胚尿囊液，放于4°C保存； (2)病毒滅活:將收集的尿囊液經(jīng)終濃度2%〇甲醒混合混勻，于37°C搖床內(nèi)滅活24 小時； (3)病毒濃縮:將滅活好的尿囊液于4°C、800化/min離屯、45min，取上清，再于4°C、 4500化/min離屯、化，棄上清后沉淀用滅菌生理鹽水重懸，得到病毒濃縮液，儲存于-70°C; (4)病毒純化:制備10%、20%、30%、40%和50%5個梯度的薦糖平衡液，在10%薦 糖液上加上病毒濃縮液，于4°C、40000r/min水平離屯、化后，收集病毒帶，于4°C、45000r/min 離屯、化后，棄上清后沉淀用滅菌生理鹽水重懸，用RT-PCR的方法檢測各帶的病毒含量，W 40 %帶病毒含量最大，作為為瓊擴抗原，儲存于-70°C，即得。 優(yōu)選的，上述鴨肝炎病毒瓊擴抗原的制備方法，所述步驟（1)中將第5代I型和第8 代虹型鴨肝炎病毒接種10日齡非免疫麻鴨胚，0.1ml/枚，于38°C解化箱解育，棄去24小時內(nèi) 接種死亡的鴨胚，收集72小時至96小時內(nèi)死亡鴨胚，4°C靜置6-8小時，收集尿囊液，放于4°C 保存。 優(yōu)選的，上述鴨肝炎病毒瓊擴抗原的制備方法，所述步驟(4)中使用20mL超速離屯、 管，超速離屯、管中每個梯度的薦糖平衡液3ml，在10%薦糖液上加病毒濃縮液3ml。 上述鴨肝炎病毒瓊擴抗原在鴨肝炎病毒抗體檢測中的應用。 優(yōu)選的，上述鴨肝炎病毒瓊擴抗原的應用，所述鴨肝炎病毒抗體檢測方法為鴨肝 炎病毒抗體瓊脂擴散試驗檢測方法。 優(yōu)選的，上述鴨肝炎病毒瓊擴抗原的應用，具體檢測方法如下： (1)樣品檢測:取標準的打孔器在瓊脂板上打梅花孔，每組7孔，共7組；中央孔加入 稀釋度為1:8的本專利技術所述鴨肝炎病毒瓊擴抗原，周圍孔加檢測樣品，并將檢測樣品進行1: 4、1: 8、1:32、1:64、1:128倍比稀釋，一組加稀釋度為1:64的陽性血清作為陽性對照，一組加 陰性血清作為陰性對照； (2)結果判定:判定標準為：出現(xiàn)沉淀線且沉淀線成環(huán)狀，與陽性對照相吻合，判定 為陽性;不出現(xiàn)沉淀線或沉淀線無規(guī)則者，判定為陰性。 優(yōu)選的，上述鴨肝炎病毒瓊擴抗原的應用，所述步驟(1)中瓊脂板是由下述方法制 備得到的： (1)制板:取瓊脂糖0.5g，NaCl 8.5g，加入蒸饋水中，在水浴中充分煮沸溶化，待瓊 脂冷卻至55°C左右時，倒入直徑90mm的平皿，每個加20ml左右，待凝固后，用封口膜封住W 防變干，放入4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?(2)打孔:取標準的打孔器打梅花型孔，中屯、孔與周圍孔距3mm，將孔中的瓊脂用針 頭輕輕挑出即可； (3)封底:在火焰上緩緩加熱，使孔底邊緣的瓊脂少許烙化W封底，W免加樣后液 體從孔底滲漏。 優(yōu)選的，上述鴨肝炎病毒瓊擴抗原的應用，所述步驟(1)中陽性血清的制備方法如 下:將滅活的第6代I型和第9代虹型鴨肝炎病毒液與弗氏完全佐劑按1:1比例進行乳化，免 疫3月齡W上健康的SPF雞，間隔15d后再次免疫，Ξ免后15d采集血清，制備成陽性血清。 優(yōu)選的，上述鴨肝炎病毒瓊擴抗原的應用，所述步驟(1)中陰性血清的制備方法如 下:采集3月齡W上健康的SPF雞血清作為陰性血清。 本專利技術的有益效果是： 上述鴨肝炎病毒瓊擴抗原，選用當前流行的鴨肝炎病毒毒株I型和虹型，通過鴨胚 繁殖、超速離屯、濃縮，薦糖梯度離屯、進行純化，制備的瓊擴標準抗原為純化高濃縮抗原，該 抗原特異性好、穩(wěn)定性高、敏感性好、產(chǎn)量高；由該抗原進行鴨肝炎病毒抗體瓊脂擴散試驗 檢測，可檢測當前流行的I型和m型鴨病毒性肝炎血清和蛋黃抗體，該方法簡單、成本低廉、 實用、有效，可W用于基層獸醫(yī)站使用，降低了檢測成本，縮短了檢測時間，還可用于鴨肝炎 病毒蛋黃抗體產(chǎn)品的監(jiān)測，具有較好的應用效果。【具體實施方式】 下面結合具體實施例對本專利技術所述技術方案作進一步的說明。 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法;下述實施例中所用的試 驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。 實施例1鴨肝炎病毒瓊擴抗原的制備 (1)病毒的獲得I型和虹型鴨肝炎病毒，為本公司實驗室從現(xiàn)地發(fā)病本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種鴨肝炎病毒瓊擴抗原，其特征在于：是由下述方法得到的：(1)病毒繁殖：將第5代Ⅰ型和第8代Ⅲ型鴨肝炎病毒接種10日齡非免疫麻鴨胚，收獲72小時至96小時內(nèi)死亡鴨胚尿囊液，放于4℃保存；(2)病毒滅活：將收集的尿囊液經(jīng)終濃度2‰甲醛混合混勻，于37℃搖床內(nèi)滅活24小時；(3)病毒濃縮：將滅活好的尿囊液于4℃、8000r/min離心45min，取上清，再于4℃、45000r/min離心2h，棄上清后沉淀用滅菌生理鹽水重懸，得到病毒濃縮液，儲存于?70℃；(4)病毒純化：制備10％、20％、30％、40％和50％5個梯度的蔗糖平衡液，在10％蔗糖液上加上病毒濃縮液，于4℃、40000r/min水平離心3h后，收集病毒帶，于4℃、45000r/min離心2h后，棄上清后沉淀用滅菌生理鹽水重懸，用RT?PCR的方法檢測各帶的病毒含量，以40％帶病毒含量最大，作為為瓊擴抗原，儲存于?70℃，即得。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：李麗琴，王建，程雪嬌，朱士江，宋秀梅，王宇鵬，葛兆寧，王勇，焦曉軍，余貴菊，甄盼盼，王猛，楊雪，于小婷，張立會，崔志剛，姜淋潔，
申請(專利權)人：天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：天津;12