一種用于肺癌診斷和預(yù)后判斷免疫組化檢測(cè)試劑制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)屬于生物檢測(cè)試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于肺癌診斷和預(yù)后判斷免疫組化檢測(cè)試劑，其特征在于，以對(duì)一種人EHD2蛋白特異的抗體作為一抗或核心抗體；以化學(xué)標(biāo)記包括熒光素、酶、金屬離子或同位素作為通用第二抗體,通過(guò)顯色等作用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)抗原(多肽和蛋白質(zhì))的表達(dá)量及其亞細(xì)胞定位；所述EHD2蛋白是指由基因EHD2編碼的蛋白，所述基因EHD2的GeneBank國(guó)際通用序列編號(hào)為：NM_014601，所述基因EHD2編碼蛋白的GeneBank國(guó)際通用序列編號(hào)為：NP_055416。本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了EHD2抗體在制備肺癌免疫組化檢測(cè)試劑中的應(yīng)用，由于EHD2蛋白參與受體與胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的多步調(diào)控，以及在各種細(xì)胞中對(duì)維持物質(zhì)運(yùn)輸與信號(hào)傳導(dǎo)等起關(guān)鍵作用，與腫瘤等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物檢測(cè)試劑
，具體設(shè)及一種用于肺癌診斷和預(yù)后判斷免疫 組化檢測(cè)試劑。
技術(shù)介紹
肺癌的全稱為"原發(fā)性支氣管肺癌"，其發(fā)病率及死亡率近年來(lái)上升速度極快。我 國(guó)肺癌發(fā)病的重點(diǎn)在城市，發(fā)病率男性為癌癥發(fā)病的第一位，女性為癌癥發(fā)病的第Ξ位。肺 癌的治愈率很低，尚屬于一種很難治愈的癌癥，究其原因在于病程進(jìn)展快，發(fā)現(xiàn)、診斷和治 療則相對(duì)較晚，早期的發(fā)現(xiàn)和診斷對(duì)肺癌的治愈至關(guān)重要。 目前在臨床上對(duì)肺癌的惡性度判別主要還是基于在組織病理水平對(duì)腫瘤組織和 腫瘤細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)形態(tài)學(xué)觀察，它對(duì)癌細(xì)胞的分化程度和侵犯特性有較強(qiáng)的辨別能力，但 是運(yùn)種基于形態(tài)學(xué)的解讀一方面受病理醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)等人為因素影響，另一方面缺乏更深層次 的與病人個(gè)體發(fā)病因素相關(guān)的分子依據(jù)。對(duì)肺癌的發(fā)生根源，即基因或相關(guān)功能性蛋白等 分子進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)肺癌診斷及預(yù)后判斷具有重要意義，免疫組織化學(xué)檢測(cè)是深刻認(rèn)識(shí)和有 效控制腫瘤惡性本質(zhì)的非常重要的方法。 免疫組織化學(xué)技術(shù)應(yīng)用免疫學(xué)抗原抗體反應(yīng)基本原理，通過(guò)抗體對(duì)體內(nèi)蛋白質(zhì)分 子抗原的特異性識(shí)別，W及化學(xué)標(biāo)記(巧光素、酶、金屬離子、同位素等）的第二抗體的顯色 等作用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)抗原（多膚和蛋白質(zhì)）的表達(dá)量及其亞細(xì)胞定位。近年來(lái)，隨 著免疫組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展和各種特異性抗體的成功研發(fā)，更主要的是對(duì)腫瘤分子機(jī)制認(rèn) 識(shí)的不斷深入，免疫組化在腫瘤的分子診斷與鑒別中的應(yīng)用價(jià)值受到了普遍的認(rèn)可。 本申請(qǐng)項(xiàng)目前期研究發(fā)現(xiàn)E皿2蛋白的表達(dá)與定位在肺癌中產(chǎn)生異變，自主研發(fā)的 EHD2特異抗體可用于肺癌的免疫組化檢測(cè)。EHD2化psinhomology化H)-domain-containing protein 2)是EHD蛋白的一種，是一類新型膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控蛋白，含有高度保守的 EH結(jié)構(gòu)域。參與受體內(nèi)吞等胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的多步調(diào)控，是整個(gè)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的必不可少的重要 環(huán)節(jié)，在多種細(xì)胞中起分子與物質(zhì)運(yùn)輸及信號(hào)傳導(dǎo)等關(guān)鍵作用，它的失調(diào)將導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào) 應(yīng)答失當(dāng)及細(xì)胞功能素亂，并可能進(jìn)而引發(fā)疾病。因此對(duì)EHD2進(jìn)行免疫組化檢測(cè)將更客觀 準(zhǔn)確地反映腫瘤的異化本質(zhì)和患者個(gè)體的臨床特性。目前，由EHD2特異抗體制備的免疫組 化試劑未見(jiàn)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為解決
技術(shù)介紹
中提到的目前在臨床上對(duì)腫瘤的判別主要還是基于在組織病理 水平對(duì)腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)形態(tài)學(xué)觀察，受病理醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)等人為因素影響較大， 缺乏更深層次的與病人個(gè)體發(fā)病因素相關(guān)的分子依據(jù)的問(wèn)題，本專利技術(shù)公布了一種用于肺癌 診斷和預(yù)后判斷免疫組化檢測(cè)試劑。 本專利技術(shù)解決的技術(shù)問(wèn)題通過(guò)W下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：[000引一種用于肺癌診斷和預(yù)后判斷免疫組化檢測(cè)試劑，是W-種對(duì)人E皿2蛋白特異的 抗體作為一抗或核屯、抗體；w化學(xué)標(biāo)記包括巧光素、酶、金屬離子或同位素作為通用第二抗 體，通過(guò)顯色等作用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)抗原（多膚和蛋白質(zhì)）的表達(dá)量及其亞細(xì)胞定 位。 所述E皿2蛋白是指由基因 EHD2編碼的蛋白，所述基因 EHD2的GeneBank國(guó)際通用序 列編號(hào)為：NM_014601，所述基因 EHD2編碼蛋白的GeneBank國(guó)際通用序列編號(hào)為：W_ 055416。 所述一種對(duì)人EHD2蛋白特異的抗體，其特征在于，所述抗體能特異性識(shí)別人EHD2 蛋白，所述識(shí)別位點(diǎn)的氨基酸序列為：503-SEQ ID NO: 1-543,由該氨基酸序列構(gòu)成的一種 多膚，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 1。 W所述多膚的氨基酸序列為核屯、序列對(duì)其進(jìn)行修飾，所述修飾為在所述多膚N端 連接一個(gè)半脫氨酸;修飾后的所述多膚經(jīng)純化后作為抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫W制備E皿2抗體 并進(jìn)行抗原純化。 所述免疫組化檢測(cè)試劑，用于對(duì)肺癌組織中EHD2的表達(dá)水平和定位進(jìn)行檢測(cè)，是 采用前述對(duì)人E皿2蛋白特異的抗體作為一抗或核屯、抗體。 作為所述通用第二抗體的酶可為辣根過(guò)氧化物酶皿P、骨型堿性憐酸酶、激酶或蛋 白酶。 有益效果 本專利技術(shù)公開(kāi)了 EHD2抗體在制備肺癌免疫組化檢測(cè)試劑中的應(yīng)用，由于E皿2蛋白參 與受體與胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的多步調(diào)控，W及在各種細(xì)胞中對(duì)維持物質(zhì)運(yùn)輸與信號(hào)傳導(dǎo)等起關(guān)鍵作 用，與腫瘤等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。因此對(duì)EHD2進(jìn)行免疫組化檢測(cè)將更客觀準(zhǔn)確地從分子 水平反映腫瘤的異化本質(zhì)和患者個(gè)體的臨床特點(diǎn)，符合腫瘤的精準(zhǔn)醫(yī)療原則和趨勢(shì)。 本專利技術(shù)公開(kāi)的EHD2抗體在制備肺癌免疫組化檢測(cè)試劑中的應(yīng)用，W對(duì)人EHD2蛋白 特異的抗體作為一抗或核屯、抗體，制備肺癌免疫組化檢測(cè)試劑，制備出的試劑特異性好，靈 敏度高，顯色性好。【附圖說(shuō)明】圖巧免疫印跡檢測(cè)結(jié)果； 圖2為肺癌組織200倍鏡下免疫組化圖：其中左上為癌旁正常組織，右下為癌組織； 圖3為肺癌組織200倍鏡下免疫組化圖； 圖4為肺癌組織400倍鏡下免疫組化圖。【具體實(shí)施方式】 W下結(jié)合附圖和實(shí)施例來(lái)對(duì)本專利技術(shù)做詳細(xì)的說(shuō)明 實(shí)施例 -種用于肺癌診斷和預(yù)后判斷免疫組化檢測(cè)試劑，其特征在于，W對(duì)人EHD2蛋白 特異的抗體作為一抗或核屯、抗體；W辣根過(guò)氧化物酶HRP作為第二抗體化學(xué)標(biāo)記，通過(guò)稀 釋、顯色等作用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)抗原（多膚和蛋白質(zhì)）的表達(dá)量及其亞細(xì)胞定位;所 述EHD2蛋白是指由基因 EHD2編碼的蛋白，所述基因 E皿2的GeneBank國(guó)際通用序列編號(hào)為： NM_014601，所述基因 E皿2編碼蛋白的GeneBank國(guó)際通用序列編號(hào)為:NP_055416;所述一種 對(duì)人E皿2蛋白特異的抗體，其特征在于，所述抗體能特異性識(shí)別人E皿2蛋白，所述識(shí)別位點(diǎn) 的氨基酸序列為:503-SEQ ID N0:l-543,由該氨基酸序列構(gòu)成的一種多膚，其氨基酸序列 為沈Q ID NO: 1。 1、E皿2免疫組織化學(xué)檢測(cè) 1)實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源： 肺癌切片取自天津市腫瘤醫(yī)院腫瘤組織標(biāo)本庫(kù)，常規(guī)脫蠟。一抗稀釋液、辣根過(guò)氧 化物酶化RP)標(biāo)記的通用二抗、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物、底物稀釋液等購(gòu)自中杉金橋。 2)免疫組化檢測(cè)試劑組配條件及樣本組織中E皿2表達(dá)與定位的檢測(cè)方法：方法主要步驟為:組織切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，內(nèi)源過(guò)氧化物酶阻斷，W1: 200滴 加實(shí)施例（1)制備得到的抗體作為一抗，4°C解育過(guò)夜。緩沖液洗3次每次5min。滴加通用HRP 酶標(biāo)二抗，在室溫下解育30分鐘。緩沖液洗3次每次5min"DAB顯色，復(fù)染，脫水封片后顯微鏡 下觀察染色情況。3)結(jié)果： 癌旁正常組織中E皿2在上皮細(xì)胞核中強(qiáng)著色、漿或膜表達(dá)陽(yáng)性(見(jiàn)圖2左上部）。癌 組織中，E皿2表達(dá)水平和定位發(fā)生異常，或幾乎為陰性（見(jiàn)圖2右下部）；或表達(dá)減弱（見(jiàn)圖 3);或核中陰性漿中增強(qiáng)（圖4當(dāng)前第1頁(yè)1 2 本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于肺癌診斷和預(yù)后判斷免疫組化檢測(cè)試劑，其特征在于，以對(duì)一種人EHD2蛋白特異的抗體作為一抗或核心抗體；以化學(xué)標(biāo)記包括熒光素、酶、金屬離子或同位素作為通用第二抗體,通過(guò)顯色等作用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)抗原(多肽和蛋白質(zhì))的表達(dá)量及其亞細(xì)胞定位；所述EHD2蛋白是指由基因EHD2編碼的蛋白；所述基因EHD2的GeneBank國(guó)際通用序列編號(hào)為：NM_014601；所述基因EHD2編碼蛋白的GeneBank國(guó)際通用序列編號(hào)為：NP_055416；所述一種對(duì)人EHD2蛋白特異的抗體是指抗體能特異性識(shí)別人EHD2蛋白，所述識(shí)別位點(diǎn)的氨基酸序列為：503?SEQ?ID?NO：1?543，由該氨基酸序列構(gòu)成的一種多肽，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：應(yīng)國(guó)光，劉博，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：天津市應(yīng)世博科技發(fā)展有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：天津;12