修復皮膚潰瘍的干細胞制劑及其制備方法技術

本發明專利技術提供了一種修復皮膚潰瘍的干細胞制劑及其制備方法，該干細胞制劑包括濃度為4～6×107個/ml的間充質干細胞和體積分數為5％-20％的血小板血漿裂解液，還包括30～50mg/ml的人血清蛋白、0.1～0.3mol/L的NaCl溶液和5～15μmol/L法舒地爾。創傷愈合是細胞因子與效應細胞相互作用的結果，外源性細胞因子的局部使用可有效促進創傷愈合，本發明專利技術將外源性的細胞因子血小板血漿裂解液與間充質干細胞混合，制成干細胞制劑，相互作用可有效促進皮膚潰瘍創傷的愈合。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及干細胞制劑及其制備方法，尤其及一種用于治療皮膚潰瘍的干細胞制劑及其制備方法。
技術介紹
慢性皮膚潰瘍又稱難治性皮膚潰瘍，是一種常見的難治性疾病，具有病因復雜、病程長和反復發作特點，可引起皮膚表皮和部分真皮甚至皮下脂肪缺損。致病因素包括糖尿病、外傷、壓迫和感染等，其中糖尿病為主要原因。目前，我國糖尿病患者約9200萬，15％～25％患者在其疾病過程中將發生足潰瘍。間充質干細胞(mesenchymalstemcells,MSCS)是中胚層來源的成體干細胞，由于來源廣泛、擴增潛能巨大、橫向分化能力強，以及可以逃避免疫識別和抑制免疫反應等其它干細胞無法比擬的優勢，目前備受研究人員的關注。近來有研究報道，在骨髓、軟骨和脂肪組織之外的臍帶血和臍帶等胎兒附屬組織中發現了MSCS。間充質干細胞是來源于發育早期中胚層的一種成體干細胞，具有自我復制和定向分化潛能特點，由于其可通過旁分泌效應和向類皮細胞分化參與創傷愈合的各個階段，具有治療皮膚潰瘍的潛在價值。目前，尚無慢性皮膚潰瘍治療指南，臨床上多采用清創術、負壓療法、抗感染藥物及敷料處理，這些方法都達不到兼具促進創面愈合和保護創面的作用，治療效果不盡人意。
技術實現思路
本專利技術需解決的技術問題是提供一種可有效促進創傷愈合的修復皮膚潰瘍的干細胞制劑。為解決上述的技術問題，本專利技術設計了一種修復皮膚潰瘍的干細胞制劑，其包括濃度為4～6×107個/ml的間充質干細胞和體積分數為5％-20％的血小板血漿裂解液。作為本專利技術進一步改進，所述修復皮膚潰瘍的干細胞制劑還包括30～50mg/ml的人血清蛋白、0.1～0.3mol/L的NaCl溶液和5～15μmol/L法舒地爾。作為本專利技術進一步改進，所述修復皮膚潰瘍的干細胞制劑還包括6～10U/mL的強力霉素。本專利技術還提供了上述修復皮膚潰瘍的干細胞制劑的制備方法，其包括以下步驟：S1：制備間充質干細胞的步驟，包括：S11：獲得人臍帶組織，經過消毒、沖洗、剪碎成組織塊之后，備用；S12：利用膠原酶Ⅱ對所述組織塊消化，再加入DMEM/F12進行培養，過濾，收集濾液；S13：將所述濾液離心，棄上清，將離心沉淀下來的細胞用含10％WT的FBS(胎牛血清)的DMEM/F12接種于培養瓶中，移入培養箱中進行培養；S14：當細胞達融合后，用胰蛋白酶溶液不完全消化進行傳代純化，傳至第三代后用完全消化進行傳代，得到間充質干細胞懸液；S2：制備血小板血漿裂解液的步驟，包括：S21：獲取骨髓，離心，吸取上層及中間的有核細胞；S22：再離心，棄上清液，加入DMEM培養液于培養箱中原代培養，得細胞懸液；S23：對所述細胞懸液離心，吸取上層血清和下層紅細胞，獲得血小板血漿裂解液；S3：配制所述修復皮膚潰瘍的干細胞制劑，將血小板血漿裂解液添加到所述間充質干細胞懸液中，邊添加，邊混合均勻。創傷愈合是細胞因子與效應細胞相互作用的結果，外源性細胞因子的局部使用可有效促進創傷愈合，本專利技術將外源性的細胞因子血小板血漿裂解液與間充質干細胞混合，制成干細胞制劑，互相作用可有效促進皮膚潰瘍創傷的愈合。具體實施方式為了使本領域相關技術人員更好地理解本專利技術的技術方案，下面將結合本專利技術實施方式，對本專利技術實施方式中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施方式僅僅是本專利技術一部分實施方式，而不是全部的實施方式。本專利技術提供一種干細胞制劑，用于治療皮膚潰瘍，促進創傷的愈合。該干細胞制劑將外源性的細胞因子血小板血漿裂解液與間充質干細胞混合，即外源性細胞因子(血小板血漿裂解液)和效應細胞(間充質干細胞)相互作用，可有效地促進創傷愈合。在本專利技術實施方式中，間充質干細胞的濃度為4～6×107個/ml和血小板血漿裂解液的體積分數為5％-20％。在其中，還包括有30～50mg/ml的人血清蛋白、0.1～0.3mol/L的NaCl溶液、5～15μmol/L的法舒地爾和6～10U/mL的強力霉素。本專利技術還提供了上述干細胞制劑的制備方法，包括以下步驟：S1：制備間充質干細胞：S11：獲得人臍帶組織，經過消毒、沖洗、剪碎成組織塊之后，備用；S12：利用膠原酶Ⅱ對所述組織塊消化，再加入DMEM/F12進行培養，過濾，收集濾液；S13：將所述濾液離心，棄上清，將離心沉淀下來的細胞用含10％FBS(胎牛血清)的DMEM/F12接種于培養瓶中，移入培養箱中進行培養；S14：當細胞達融合后，用胰蛋白酶溶液不完全消化進行傳代純化，傳至第三代后用完全消化進行傳代，得到間充質干細胞懸液；S2：制備血小板血漿裂解液：S21：獲取骨髓，離心，吸取上層及中間的有核細胞；S22：再離心，棄上清液，加入DMEM培養液于培養箱中原代培養，得細胞懸液；S23：對所述細胞懸液離心，吸取上層血清和下層紅細胞，獲得血小板血漿裂解液；在之后，還對所述血小板血漿裂解液進行凍存，再解凍，反復凍存解凍至少3次以上。S3：配制所述修復皮膚潰瘍的干細胞制劑，將血小板血漿裂解液、30～50mg/ml的人血清蛋白、0.1～0.3mol/L的NaCl溶液和5～15μmol/L法舒地爾以及6～10U/mL添加的步驟添加到所述間充質干細胞懸液中，邊添加，邊混合均勻。下面結合具體的實施例對本專利技術進一步詳細說明實施例一：制備間充質干細胞懸液取足月剖宮產胎兒的臍帶約4～6cm長，在無菌條件下抽凈臍帶血，將約4～6cm長臍帶放入超凈臺中，去除動靜脈及外膜，PBS進行初次漂洗幾次，剪成1cm小段，再用PBS多次漂洗以盡可能去除血液，最后剪成肉糜狀。將肉糜狀人臍帶組織塊移入50mL離心管，加入5mL的、經37℃預熱的、質量分數為0.1％的膠原酶Ⅱ(100mlPBS緩沖液溶解0.1g膠原酶)，放入37℃水浴搖床中振蕩消化180min，再加入30mL的DMEM/F12培養，反復吹打，細胞篩過濾，收集濾液。該濾液用1000轉/min離心10min，棄上清，將離心沉淀下來的細胞按1×106/mL的密度用含10％WT的FBS(胎牛血清)的DMEM/F12接種于培養瓶中，移入培養箱中進行培養，次日首次換液，以后每3d換液1次。當細胞達融合后，用胰蛋白酶溶液(胰蛋白酶溶液配制：PBS緩沖液200mL，胰蛋白酶0.5g，EDTA(乙二胺四乙酸)0.04g)不完全消化進行傳代純化，傳至第三代后用完全消化進行傳代，得到間充質干細胞懸液。制備血小板血漿裂解液無菌條件下用含100U/mL低分子量肝素鈉的無菌針管從髂后上脊取骨髓30mL，生物安全柜中轉入50mL的無菌離心管中，在200g/min的條件下離心6min，離心后可見骨髓分為3層，吸取上層及中間富含的有核細胞，將有核細胞轉至另一離心管，1000g離心6min，棄上清液；下層加入DMEM培養液(含體積分數為10％血清、8U/mL強力霉本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種修復皮膚潰瘍的干細胞制劑，其特征在于，包括濃度為4～6×107個/ml的間充質干細胞和體積分數為5％?20％的血小板血漿裂解液。

【技術特征摘要】
1.一種修復皮膚潰瘍的干細胞制劑，其特征在于，包括濃度為
4～6×107個/ml的間充質干細胞和體積分數為5％-20％的血小板血漿裂
解液。
2.根據權利要求1所述的修復皮膚潰瘍的干細胞制劑，其特征在于，
還包括30～50mg/ml的人血清蛋白、0.1～0.3mol/L的NaCl溶液和5～15
μmol/L的法舒地爾。
3.根據權利要求2所述的修復皮膚潰瘍的干細胞制劑，其特征在于，
還包括6～10U/mL的強力霉素。
4.一種修復皮膚潰瘍的干細胞制劑的制備方法，其特征在于，包括
以下步驟：
S1：制備間充質干細胞的步驟，包括：
S11：獲得人臍帶組織，經過消毒、沖洗、剪碎成組織塊之后，備用；
S12：利用膠原酶Ⅱ對所述組織塊消化，再加入DMEM/F12進行培
養，過濾，收集濾液；
S13：將所述濾液離心，棄上清，將離心沉淀下來的細胞用含10％WT
的FBS的DMEM/F12接種于培養瓶中，移入培養箱中進行培養；
S14：當細胞達融合后，用胰蛋白酶溶液不完全消化進行傳代純化，
傳至第三代后用完全消化進行傳代，得到間充...

【專利技術屬性】
技術研發人員：曾憲卓，魯菲，
申請(專利權)人：深圳愛生再生醫學科技有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44