一種降低單克隆抗體生產中宿主細胞蛋白含量的親和純化工藝制造技術

本發明專利技術公開了一種抗體純化過程中有效降低宿主細胞蛋白（HCP）的新方法。該工藝開發方法包括層析過程中親和填料、緩沖液系統、活性試劑的選擇以及層析步驟。本發明專利技術廣泛適用于抗體親和純化工藝中，且所使用的材料成本價格較低，易于工藝放大。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，尤其涉及一種降低單克隆抗體生產中宿主細胞蛋白（HCP）含量的親和純化工藝方法。
技術介紹
抗體藥物生產過程中親和純化是非常關鍵的一個工藝步驟，該過程對發酵液中的抗體進行捕獲濃縮，實現抗體粗純化的第一步。在中國倉鼠卵巢細胞（CHO）等基因工程細胞株大批量發酵過程中，細胞在不同的生理周期會有凋亡裂解，釋放宿主細胞蛋白(Hostcellprotein，HCP)。HCP是指來源于宿主細胞的蛋白成分，包括宿主細胞結構蛋白和轉化蛋白（細胞分泌的促生長蛋白）。HCP不僅有可能誘導機體產生抗HCP抗體，引起過敏反應，還有可能有“佐劑效應”引起機體對蛋白質藥物產生抗體，影響藥物治療效果，定量測定基因工程藥物中殘留的HCP是質量控制的一種重要手段，有助于保持純化工藝的有效性和一致性。在抗體親和純化中，保證高效率的抗體回收率的同時，要對發酵過程中工程細胞所產生的HCP進行有效去除。因此，研究出一種能廣泛應用于抗體大規模發酵后較為經濟可行的抗體親和純化工藝，對于抗體藥物的進一步產業化推廣是極其有意義的，本專利技術涉及即是此方面內容。目前能夠進行HCP殘留去除的方法較多，各有特點：1）層析方式：包括ProteinA親和層析，陰、陽離子層析，三種層析工藝中對HCP的去除能力，ProteinA親和層析為基礎，去除能力較強，是HCP去除的主要步驟，陰、陽離子層析則主要作為后續HCP的進一步再去除工藝。層析方式去除HCP的工藝在不斷完善過程中，各種層析工藝在不斷的提出應用實際生產，是HCP去除的主要手段；2）切向流超濾方式：對于HCP的去除能力有限，且不易控制殘留量，工藝控制系數不高，只能作為去除HCP的輔助工藝；3）聚合物沉淀方式：PEG、聚丙烯酸等高聚合物在較廣的PH范圍內帶正電荷，通過電荷作用同抗體結合形成沉淀，而HCP由于等電點較低，不易發生沉淀。沉淀抗體樣品的HCP含量明顯降低，但該工藝不適于工藝放大，且沉淀對抗體的活性可能有一定影響。因此，去除HCP的工藝方法眾多，由于各項目的抗體的樣品發酵工藝及抗體性質的不同，需進行綜合考慮選擇工藝。本專利技術所述工藝的原理，是利用在親和層析的預洗脫中降低HCP同抗體及填料基質間的作用，即通過聚山梨酯80（Tween80）、聚山梨酯20（Tween20）、尿素等活性試劑能夠不同程度地減弱HCP同抗體蛋白及填料介質間的作用力，而起到去除HCP的作用。
技術實現思路
本專利技術為了解決抗體生產中宿主細胞蛋白（HCP）殘留的問題，而公開了一種抗體純化生產中有效降低CHO宿主細胞蛋白（HCP）的新方法，可以廣泛適用于抗體親和純化工藝中，且所使用的材料成本價格較低，易于工藝放大。在本專利技術中，主要通過抗體親和層析中間預洗脫來有效降低HCP含量，滿足抗體藥物的大規模高質量純化制備要求，保證抗體藥物的臨床使用的安全。為了達到本專利技術中的目的主要采取以下措施：1.收集發酵上清液。2.親和層析。發酵液進行親和層析，親和介質包括但不限于ProteinA、ProteinG、ProteinL等可同抗體特異性結合的配基交聯到瓊脂糖、羥基化聚醚樹脂、聚丙烯酸樹脂、聚苯乙烯二乙烯苯基樹脂、聚甲基丙烯酸樹脂、聚苯乙烯樹脂、羥基磷灰石、玻璃等基質上的層析介質，優選基質為瓊脂糖。優選的親和填料有GEhealthcare的Mabselect、MabselectSure，博格隆生物技術有限公司的ProteinAdiamond等。優選的親和介質配基為ProteinA或在ProteinA基礎上做結構優化的配基。層析步驟如下：2.1上樣：上樣緩沖液包括但不限于磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液等，優選為磷酸鹽緩沖液或Tris-鹽酸緩沖液，更優選的可在緩沖液中加入NaCl或Na2SO4來降低非抗體蛋白同ProteinA填料間的非特異性吸附，所述磷酸鹽緩沖液的鹽濃度為5mM-0.15M之間，優選的為10mM-50mM之間，更優選的是20mM；pH為5.5-8.0之間；優選的為6.5-7.5之間，更優選的是7.0，NaCl或Na2SO4的濃度優選為0-250mM，更優選的可為150mM2.2中間洗脫：中間洗脫緩沖液包括但不限于以下緩沖液中的一種或幾種的組合：1）中性緩沖液體系，例如：磷酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸等；2）酸性的緩沖液體系：檸檬酸-磷酸氫二鈉、醋酸-醋酸鈉、檸檬酸-檸檬酸三鈉等。中間洗脫緩沖液中可添加活性試劑，包括但不限于聚山梨酯80（Tween80）、聚山梨酯20（Tween20）、尿素、異丙醇、丙二醇、乙二醇、四甲基氯化銨等，優先的為Tween80，Tween80的濃度在0.05%-5%之間，優選的是0.1%-1%之間，更優選的是0.5%。所述中間預洗脫緩沖液的鹽濃度范圍在0M-0.5M之間，優選為0.15M。中間洗脫緩沖液的pH為5.0-7.5之間，優選的是7.0。2.3終洗脫：洗脫緩沖液包括但不限于以下緩沖液中的一種或幾種的組合：檸檬酸、Gly-鹽酸及醋酸緩沖液等，PH范圍從2.0-7.0，優選的PH為3.0-4.0。洗脫緩沖液的濃度范圍為5-100mM，優選的為20-50mM。洗脫后可將親和介質再生，再生緩沖液包括但不限于檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液、鹽酸、甘氨酸、NaOH，優先為檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液及NaOH溶液。在其中一個實施例中，所用的抗體為人源化兔抗人血管內皮生長因子（VEGF）IgG1型單克隆抗體，這是一種可用于治療年齡相關性黃斑病變（AMD）的藥物。在另一個實施例中，所用的抗體是一種完全人源性抗TNF-aIgG1型單克隆抗體，適用于治療中度和嚴重風濕性關節炎、銀屑病關節炎、強直性脊柱炎和克羅恩病。在另一個實施例中，所用的抗體抗RANKL（receptoractivatorofnuclearfactorkappa-Bligand，即核因子κB配體受體激活劑）的人源IgG2型單克隆抗體，用于預防絕經期婦女骨質疏松相關性骨折。所選用的抗體類型只為說明本專利技術，本領域技術人員可以理解的是，本專利技術所述的方法可適用于其他類型的抗體。本專利技術中的抗體ProteinA親和純化工藝簡單易行，能夠進行放大純化生產，細胞發酵上清液無需進行前預處理，洗脫樣品得率較高，同時HCP殘留量也保持在較低水平（殘留控制量不高于0.05%），從而減輕之后純化步驟中去除HCP的壓力，從而保證抗體最終樣品的HCP殘留量處于極低水平。同時，專利技術中經過對不同抗體發酵上清液進行親和純化工藝驗證，證明本專利技術中的親和純化工藝具有較強的適用性及良好的穩定性。具體實施方式以下通過特定的具體實例說明本專利技術的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本專利技術的其他優點與功效。本專利技術還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本專利技術的精神下進行各種修飾或改變。哺乳動物細胞本專利技術所述單克隆抗體體外發酵生產使用的哺乳動物細胞包括但不限于目前通用的各種雜交瘤細胞、中國倉鼠卵巢細胞（CHO），優選的是CHO細胞。抗體<本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種去除人源化單克隆抗體宿主細胞蛋白的親和純化工藝方法，包括如下步驟：收集人源化單克隆抗體發酵液后將發酵液進行親和層析，其特征為所述親和層析過程中，上樣平衡后先進行中間預洗脫，再進行終洗脫。

【技術特征摘要】
1.一種去除人源化單克隆抗體宿主細胞蛋白的親和純化工藝方法，包括如下步驟：收集人源化單克隆抗體發酵液后將發酵液進行親和層析，其特征為所述親和層析過程中，上樣平衡后先進行中間預洗脫，再進行終洗脫。
2.根據權利要求1所述去除人源化單克隆抗體宿主細胞蛋白的親和純化工藝方法，所述親和層析親和介質為配基交聯到瓊脂糖、羥基化聚醚樹脂、聚丙烯酸樹脂、聚苯乙烯二乙烯苯基樹脂、聚甲基丙烯酸樹脂、聚苯乙烯樹脂、羥基磷灰石或玻璃基質上的層析介質。
3.根據權利要求1所述去除人源化單克隆抗體宿主細胞蛋白的親和純化工藝方法，其特征為所述的上樣平衡所用的上樣緩沖液為磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液或硼酸-硼砂緩沖液，鹽濃度為5mM-0.15M，pH為5.5-8.0。
4.根據權利要求1所述去除人源化單克隆抗體宿主細胞蛋白的親和純化工藝方法，其中所述的中間預洗脫所用的中間預洗脫緩沖液體系為磷酸鹽緩沖液、檸檬酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液或醋酸鈉-醋...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王齊磊，吳亦亮，陳紫鵑，曹雨霞，游猛，陳寅，李濤，
申請(專利權)人：江蘇泰康生物醫藥有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇;32