本發明專利技術公開了一種體外培養成骨細胞的培養基。其特征在于：包括基礎培養基10.0-15.0g/L，銀耳多糖100-300mg/L，血清8-10mL，適量碳酸氫鈉調pH值為7.2-7.6，加水定容至1L；所述的基礎培養基為DMEM,α-MEM，RPMI-1640，F12，DMEM/F12；所述的銀耳多糖的純度大于75%；所述的血清為胎牛血清、小牛血清、人血清、馬血清和羊血清；本發明專利技術的培養基用于體外培養成骨細胞。本發明專利技術的有益效果在于能夠加快成骨細胞的生長，且能減少血清的使用量。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物
的一種動物細胞體外培養的培養基，具體涉及的是一種體外培養成骨細胞的培養基。
技術介紹
由于許多因素的影響，骨組織結構、功能及骨代謝等方面的研究直接通過人體來進行受到限制，因此體外培養成骨細胞，作為常用的體外實驗模型，成為研究骨生理、病理及修復組織工程的基礎。1964年，Peck等就開始從事動物胚胎骨成骨細胞培養的研究工作，1979年Mills等首先報道用組織塊培養法在體外成功培養了人成骨細胞，此后陸續有成功培養成骨細胞的報道。主要的方法分為酶消化法和組織塊法，及改良的酶消法-組織塊法聯合培養方法。這些方法采用的培養基多為基礎培養基加一定比例的胎牛血清制成的培養液。一般情況下，從骨組織中游離的成骨細胞接種于培養瓶后需要20-30天之后才能達到匯合傳代，而且胎牛血清的體積含量比較高，一般會達到20%以上，胎牛血清的消耗比較大。因此，希望能夠提供一種成骨細胞的培養基，能夠加快成骨細胞的生長，且能減少血清的使用量。銀耳多糖(TremeI lam)是從銀耳(Treme I la fuciformisBerk)的子實體中得到的多糖，其主鏈結構是由α_( 1—3)糖苷鍵連接的甘露聚糖，支鏈由葡萄糖醛酸和木糖組成。銀耳多糖的在體內的功能主要集中在兩個方面，一是針對非免疫系統，促進胃腸遭有益微生物生長，調節腸道理想微生物菌群的形成，增強動物對外源性病原菌的抵抗能力;二是針對免疫防御系統，提高體液免疫能力，增強吞噬細胞吞噬能力；提高淋巴細胞活性和功能，促進細胞因子生長，保護紅細胞膜不易受到氧化損傷。其作用尤其表現在可預防和治療由放射與抗腫瘤藥物(如CTX)引起的骨髓抑制。試驗結果顯示，用Co60射線進行放療者，骨髓中有核細胞數，比不授予銀耳多糖的對照組多186%。可見，銀耳多糖可用于抑制骨髓抑制作用，可促進成骨細胞生長。但目前沒用將銀耳多糖用于體外培養成骨細胞。
技術實現思路
專利技術目的本專利技術提供一種體外培養成骨細胞的培養基，能夠加快成骨細胞的生長，且能減少血清的使用量。技術方案—種體外培養成骨細胞的培養基:包括基礎培養基10.0-15.0g/L，銀耳多糖100-300mg/L，血清8-10mL，適量碳酸氫鈉調pH值為7.2-7.6，加水定容至11^所述的基礎培養基為01^]?，€\^]\1，1^]\0-1640，？12，01^]\0712;所述的銀耳多糖的純度大于75%;所述的血清為胎牛血清、小牛血清、人血清、馬血清和羊血清;本專利技術的培養基用于體外培養成骨細胞。有益效果本專利技術特異性用于成骨細胞的體外培養。試驗結果表明，本專利技術能用于酶消化法、和組織塊法，及改良的酶消法-組織塊法聯合培養方法制備的成骨細胞，能夠加快成骨細胞的生長，且能減少血清的使用量。【具體實施方式】實施例1低糖DMEM15.0g(HyClone)，銀耳多糖100mg/L，小牛血清10mL，適量碳酸氫鈉調pH值為7.2，加水定容至1L。實施例2a-MEM 15.0g(HyClone)，銀耳多糖200mg/L，胎牛血清8mL，適量碳酸氫鈉調pH值為7.4，加水定容至1L。實施例3酶消化法:取新生大鼠，75%乙醇浸泡，取頭蓋骨;將頭蓋骨置于磷酸緩沖液內，清除骨膜、血管等結締組織，將洗凈的頭蓋骨剪成小片。將骨片用0.25%胰蛋白酶消化;終止反應后，再用0.1% Π型膠原酶將骨片消化分離細胞;將含細胞的消化液離心lOmin，沉淀的細胞團塊用實施例1制得的培養基制成細胞懸液，按需密度接種于細胞培養瓶中，置于5%C02培養箱中培養。24h后，換液I次，以后每二三天換液I次，培養約12d后達到匯合后傳代。實施例4組織塊法:取新生大鼠，75%乙醇浸泡，取頭蓋骨；用磷酸緩沖液沖洗后剪成小塊，用上清液反復沖洗至發白；用0.25 %胰蛋白酶溶液消化，棄消化液，剩余小塊移入培養瓶；加入實施例2制得的培養基，使小塊均勻分布于瓶底;將培養瓶輕放入5%C02培養箱中培養。凈置2-3天，待細胞從骨塊邊長出后換培養基并棄骨塊。每2-3天換液I次，培養約1d后達到匯合后傳代。實施例5改良酶消化法:取新生大鼠，75%乙醇浸泡，取頭蓋骨；用磷酸緩沖液沖洗后剪成小塊;加入磷酸緩沖液，反復振蕩、沖洗3次，直到骨塊呈白色蜂窩狀;棄磷酸緩沖液，加入0.25%胰蛋白酶消化。棄消化液(0.25%胰蛋白酶)，用實施例2制得的培養基洗滌2次，再用磷酸緩沖液洗I遍。棄磷酸緩沖液，用lg/L的Π型膠原酶消化。加入實施例2制得的培養基終止消化，離心后用實施例2制得的培養基洗滌3次。棄洗滌液，加入實施例2制得的培養基吹打骨塊，使更多成骨細胞游離出來，吹散細胞沉淀后，加入到細胞培養瓶中；所有培養瓶置入37°C，5%C02培養箱中培養;24h后，換液I次，以后每3天換液I次，培養約7d后達到匯合后傳代。實施例6成骨細胞堿性磷酸酶(ALP)染色鑒定:實施例3、實施例4和實施例5得到的細胞按2X 1Vcm2的密度接種于25ml細胞培養瓶，分別培養7、10、14、20天后，用95%酒精固定15min，干燥后，用孵育液(2%巴比妥鈉5πι1+3%β-甘油磷酸鈉5ml+2%硝酸鈣10ml+2%硫酸鎂5ml+蒸餾水25ml，其中2%硝酸鈣、2%硝酸鈷和I %硫化銨，臨用前新鮮配制)37°C孵育2h，蒸餾水沖洗，加2 %硝酸鈣作用2min，再加2 %硝酸鈷作用2min，蒸餾水沖洗，I %硫化銨作用lmin，自來水洗。結果顯示:實施例3、實施例4和實施例5得到的細胞堿性磷酸酶呈強陽性，鑒定為成骨細胞。實施例7實施例5得到的鼠成骨細胞的增值率:采用MTT比色法。將對數生長的鼠成骨細胞，以1.0 X 15加入96孔培養板中，培養24h，實驗孔加入實施例2培養基；空白組加入相同體積的DMEM培養基(HyClone，含胎牛血清20 % )。每孔設五個復孔，培養48h，每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育30min，在酶標儀620nm處測定吸光度A值，按公式成骨細胞增殖率=(I一實驗組吸光值/對照組吸光值)X 100%。實施例2培養基培養的鼠成骨細胞的增值率為214.9±23.6%，與普通培養基培養的鼠成骨細胞相比有顯著性差異(p<0.05)。【主權項】1.一種體外培養成骨細胞的培養基:其特征在于:包括基礎培養基10.0-15.0g/L，銀耳多糖100-30011^/1，血清8-101^，碳酸氫鈉調?!1值為7.2-7.6，加水定容至1 L。2.根據權利要求1所述的體外培養基，其特征在于:所述的基礎培養基為DMEM，α-ΜΕΜ，RPM1-1640，Fl2，DMEM/F12。3.根據權利要求1所述的體外培養基，其特征在于:所述的銀耳多糖的純度大于75%。4.根據權利要求1所述的體外培養基，其特征在于:所述的血清為胎牛血清、小牛血清、人血清、馬血清和羊血清。5.根據權利要求1-4任一所述的體外培養基，其特征在于:用于體外培養成骨細胞。【專利摘要】本專利技術公開了一種體外培養成骨細胞的培養基。其特征在于：包括基礎培養基10.0-15.0g/L，銀耳多糖100-300mg/L，血清8-10mL，適量碳酸氫鈉調pH值為7.2-7.6，加水定容至1L；所述的基礎培養基為DMEM,α-MEM，RPMI-16本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種體外培養成骨細胞的培養基：其特征在于：包括基礎培養基10.0?15.0g/L，銀耳多糖100?300mg/L，血清8?10mL，碳酸氫鈉調pH值為7.2?7.6，加水定容至1?L。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：羅瑞雪，
申請(專利權)人：蘇州普羅達生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇;32
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