利用黃萎病菌VdP4-ATPase基因提高植物對黃萎病抗性的方法技術

本發明專利技術涉及編碼黃萎病菌P類ATPase的VdP4-ATPase基因在提高植物對黃萎病抗性中的用途，以及提高植物對黃萎病抗性的方法，通過在目標植物體內表達編碼黃萎病菌P類ATPase的VdP4-ATPase基因而提高所述植物對黃萎病的抗性。本發明專利技術利用對病原菌毒素的解毒而提高植物的抗性，不具有病原菌小種抗性的特點。因此，可以廣泛應用于提高不同病原菌生理小種的抗性，不存在小種專一性抗性的特點。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于植物基因工程領域。具體地說，涉及利用基因工程技術提高植物抗病性的方法。技術背景黃萎病嚴重影響作物的產量和品質，全球每年因黃萎病引起的損失達數十億美元(Peggetal.,2002)。報道稱馬鈴薯因感染黃萎病年產量減少50％以上，通常情況下可以引起10-15％的減產(Powelsonetal.,1993；Roweetal.,1987，2002)；生菜種植區，黃萎病引起的損失非常容易達到100％(Subbaraoetal.,1997)；Levinet(2003)等研究發現，油橄欖因黃萎病引起的減產可以達到70％以上；黃萎病也是多數植棉國家的棉花主要病害，比如，澳大利亞、巴西、保加利亞、中國、希臘、秘魯、土耳其、烏干達、美國和烏茲別克斯坦等國家，可以造成30％以上棉花的減產(Boleketal.,2005)，發病嚴重的地區或年份減產可以達到100％。黃萎病是制約我國棉花生產的一種主要病害，目前我國各棉區的發病面積已占植棉總面積的50％以上，每年損失皮棉7.5-10萬噸，直接經濟損失16-20億元(肖松華等,2006)。在我國棉花黃萎病重病地塊逐年增多，危害逐年加重，已成為當前實現棉花高產、穩產的主要限制因素。黃萎病不僅引起作物大量減產和產品品質降低，其致病菌產生的毒素也能危害人類的健康。黃萎病主要是由大麗枝菌VerticilliumdahliaeKleb和黑白輪枝菌Verticilliumalboatrum侵染引起的一種土傳維管束病害。病原菌一旦侵入植物體內，便沒有有效的防治方法。黃萎病菌寄主范圍廣，可以侵染包括所有雙子葉植物在內的200多種植物，病原菌能以微菌核的形式在土壤中存活20年左右(Klostermanetal.,2009)，除2001年Kawchuk等從番茄中克隆得到1個針對茄屬黃萎病菌的抗病基因Ve以外，幾乎沒有克隆到來自其他植物的抗病基因，對Ve抗病基因的機制研究表明該基因只對黃萎病菌的部分小種具有抗性(Fradinetal.,2009)。早期的研究認為，植物感染黃萎病后，其導管被孢子、菌絲以及病原菌通過植物細胞形成的膠狀物等堵塞而致萎蔫壞死(Agrios,2005)，但是，隨后的研究表明，導管堵塞不是黃萎病萎蔫的主要原因，隨著研究的不斷深入，人們認識到黃萎病菌產生的毒素是導致植物萎蔫的重要因素(Fradinetal.,2006)。還有一些學者認為，維管束的堵塞也是基于毒素的誘導效應(陳旭升等，1998)。實踐證明，利用抗病品種是防治黃萎病危害的唯一經濟有效的途徑。傳統育種方法雖然能利用作物本身或親緣種的抗性基因選育抗病品種，但存在著可利用的抗性品種資源少，選育時間長，耗資大等缺點；施用化學藥劑不僅難以有效防治黃萎病而且污染環境。隨著植物基因工程技術的不斷發展以及對植物和病原物相互作用的深入了解使得將外源抗性基因導入植物來提高抗病性成為一條有效途徑。通過轉基因技術可以打破傳統育種中的種間不親和現象，消除雜交障礙，極大地拓寬了抗性基因的來源和應用(GroverandGowthama,2003)。利用外源抗病基因產物抑制黃萎病菌在植株體內的生長和繁殖可以提高植物對黃萎病的抗性，另一方面，基于黃萎病菌毒素的致病機理，提高植物對黃萎病菌毒素的解毒能力，也是提高植物對黃萎病抗性的有效方法之一。但是，絕大數研究者主要利用前一種方法達到提高植物抗性的目的，尚未見成功利用外源基因的表達產物解毒病原菌產生的毒素來提高對黃萎病抗性的報道。
技術實現思路
本專利技術的一個目的在于提供編碼黃萎病菌P類ATPase的VdP4-ATPase基因在提高植物對黃萎病抗性中的用途，通過將編碼黃萎病菌P類ATPase的VdP4-ATPase基因整合進入目標植物構建轉基因植物，并使得所述VdP4-ATPase基因在植物中表達而提高植物對黃萎病的抗性。本專利技術的另一個目的在于提供一種提高植物對黃萎病抗性的方法，通過在目標植物體內表達外源基因而提高所述植物對黃萎病的抗性，所述外源基因為編碼黃萎病菌P類ATPase的VdP4-ATPase基因。具體地，本專利技術是將含有SEQIDNO.9所示核苷酸序列的黃萎病菌VdP4-ATPase基因整合入植物中，實現這些基因的組成型表達，提高轉基因植物對黃萎病菌毒素的解毒能力，進而獲得抗黃萎病的轉基因植物。更具體地，本專利技術的方法，包括下述步驟：將VdP4-ATPase基因整合進入目標植物構建轉基因植物，并使得所述VdP4-ATPase基因在植物中表達。優選地，所述的方法，包括下述步驟：1)構建含有來自黃萎病菌VdP4-ATPase基因的重組植物表達載體；2)將所述重組植物表達載體導入目標植物中，使得VdP4-ATPase基因在目標植物中組成型表達；3)獲得具有提高的抗黃萎病的轉基因植物。優選地，所述VdP4-ATPase基因的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。本專利技術的方法可以適用于的目標植物優選為番茄、煙草或棉花。本專利技術方法中，步驟1)中的重組植物表達載體具有如圖4所示的結構。本專利技術的再一個目的是提供一種具有黃萎病抗性的轉基因植物的制備方法，包括以下步驟：i)獲得編碼黃萎病菌P類ATPase的VdP4-ATPase基因，并將其可操作地插入植物表達載體中，構建植物表達載體；ii)用步驟i)獲得的植物表達載體轉化宿主，獲得轉化體；iii)用步驟ii)獲得的轉化體轉化植物，獲得轉基因植物。本專利技術利用黃萎病菌VdP4-ATPase基因提高植物對黃萎病抗性的方法，具體包括如下的步驟：1)獲得黃萎病菌VdP4-ATPase基因：引入SpeI和SmaI酶切位點設計引物，然后以黃萎病菌cDNA為模板進行PCR擴增，擴增產物即為添加酶切位點的VdP4-ATPase基因序列；2)構建組成型表達VdP4-ATPase基因的植物表達載體：將擴增獲得的VdP4-ATPase基因序列連接入植物表達載體pLGN-35S-Nos，構建一個新的植物表達載體，命名為pLGN-35S-VdP4-ATPase；3)植物的遺傳轉化：利用根癌農桿菌介導法，將上述步驟2)獲得的pLGN-35S-VdP4-ATPase植物表達載體整合入植物基因組，實現VdP4-ATPase基因在轉基因植物內的組成型表達，提高轉基因植物對黃萎病的抗性；4)抗黃萎病的VdP4-ATPase轉基因植株的獲得：將步驟3)獲得的轉基因植物進一步進行繁殖、分子鑒定和抗病鑒定，獲得對黃萎病抗性提高的VdP4-ATPase轉基因植株。進一本文檔來自技高網...

【技術保護點】
編碼黃萎病菌P類ATPase的VdP4?ATPase基因在提高植物對黃萎病抗性中的用途，其中通過將VdP4?ATPase基因整合進入目標植物構建轉基因植物，并使得所述VdP4?ATPase基因在植物中表達而提高植物對黃萎病的抗性。

【技術特征摘要】
1.編碼黃萎病菌P類ATPase的VdP4-ATPase基因在提高植物對黃萎病抗性中的用途，其
中通過將VdP4-ATPase基因整合進入目標植物構建轉基因植物，并使得所述VdP4-ATPase基
因在植物中表達而提高植物對黃萎病的抗性。
2.如權利要求1所述的用途，其中所述VdP4-ATPase基因的核苷酸序列如SEQIDNO.9
所示。
3.一種提高植物對黃萎病抗性的方法，其中通過在目標植物體內表達外源基因而提高
所述植物對黃萎病的抗性，所述外源基因為編碼黃萎病菌P類ATPase的VdP4-ATPase基因。
4.權利要求3所述的方法，包括下述步驟：
將編碼黃萎病菌P類ATPase的VdP4-ATPase基因整合進入目標植物構建轉基因植物，并
使得所述VdP4-ATPase基因在植物中表達。
5.如權利要求3所述的方法，包括下述步驟：
1)構建含有來自編碼黃萎病菌P類ATPase的VdP4-ATPase基因的重組植物表達載體；
2)將所述重組植物表達載體導入...

【專利技術屬性】
技術研發人員：裴炎，李玉杰，陳楊，范艷華，侯磊，李先碧，宋水清，
申請(專利權)人：西南大學，
類型：發明
國別省市：重慶;85