布魯氏菌屬2,4-二氧四氫蝶啶合酶和AB5毒素β亞基的嵌合體制造技術

本發明專利技術涉及嵌合多肽，所述嵌合多肽作為用于在哺乳動物中誘導針對志賀毒素(Stx)的保護性免疫應答以及中和抗體的免疫原有用。具體而言，本發明專利技術涉及嵌合多肽以及由所述嵌合多肽形成的寡聚蛋白復合體，所述嵌合多肽包含與布魯氏菌屬2,4-二氧四氫蝶啶合酶的單體的N末端融合的志賀2毒素的同五聚體B亞基的單體。本發明專利技術還涉及編碼所述嵌合多肽的多核苷酸和載體、包含所述多核苷酸和載體的轉基因細胞、以及包含所述嵌合多肽和嵌合多核苷酸的藥物組合物(如疫苗)。結合本發明專利技術的嵌合多肽的抗體、用于獲得特異性結合志賀2毒素的B亞基的抗體的方法以及降低哺乳動物中腸出血性大腸桿菌的細菌負荷的方法(所述方法可用于預防特別是溶血性尿毒綜合征(HUS))也在本發明專利技術的范圍內。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及嵌合多肽，所述嵌合多肽作為用于在哺乳動物中誘導針對志賀毒素(Shigatoxin，Stx)的保護性免疫應答以及中和抗體的免疫原有用。具體而言，本專利技術涉及嵌合多肽以及由所述嵌合多肽形成的寡聚蛋白復合體，所述嵌合多肽包含與布魯氏菌屬(Brucella)2,4-二氧四氫蝶啶合酶(lumazinesynthase)的單體的N末端融合的志賀2毒素的同五聚體(homopentameric)B亞基的單體。本專利技術還涉及編碼所述嵌合多肽的多核苷酸和載體、包含所述多核苷酸和載體的轉基因細胞、以及包含所述嵌合多肽和嵌合多核苷酸的藥物組合物(如疫苗)。結合本專利技術的嵌合多肽的抗體、用于獲得特異性結合志賀2毒素的B亞基的抗體的方法以及降低哺乳動物中腸出血性大腸桿菌(Escherichiacoli)的細菌負荷(bacterialload)的方法(所述方法可用于預防特別是溶血性尿毒綜合征(HUS))也在本專利技術的范圍內。
技術介紹
腸出血性大腸桿菌(EHEC)菌株是人類重要的食源性致病菌(Kaper等，2004.NatRevMicrobiol2:123-140)。EHEC感染的臨床表現從水樣腹瀉或出血性結腸炎(HC)至最嚴重的結果，即危及生命的溶血性尿毒綜合征(HUS)(Karmali1989.ClinMicrobiolRev2:15-38)。感染與受污染的肉或蔬菜的攝取相關，但也通過水或者甚至人對人的接觸傳播(Caprioli等，2005.VetRes36:289-311；Griffin和Tauxe，1991.EpidemiolRev13:60-98)。在一些發達國家中報道了零星或大規模爆發。在其它國家(如阿根廷)，HUS顯示出地方性特性，并表現為具有高發病率和死亡率值的嚴重公共衛生問題(Lopez等，2000.InfectDisClinNorthAm14:41-65,viii；Rivas等，2006.Medicina(BAires)66Suppl3:27-32)。EHEC感染的顯著特點是強有力的志賀毒素的產生，對HUS發展負有責任(Noel和Boedeker，1997.DigDis15:67-91；O’brien等，CurrTopMicrobiolImmunol180:65-94)。志賀毒素家族是一組在結構上和功能上相關的AB5外毒素(exotoxins)，包括由痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)血清型1生產的志賀毒素(Stx)和由腸出血性大腸桿菌(EHEC)菌株生產的志賀毒素。EHEC可生產兩類Stx，志賀毒素1型(Stx1)和志賀毒素2型(Stx2)以及它們的等位基因變體(allelicvariants)。志賀毒素的基因由溶原性λ形細菌噬菌體編碼(Schmidt，2001.ResMicrobiol152(8):687-95)，并且給定細菌可表達多于一種Stx，因為它們可能包含多于一種編碼Stx的細菌噬菌體。所有志賀毒素家族成員均具有AB5分子構型(Stein等，1992.Nature355(6362):748-50；Fraser等，1994.NatStructBiol1(1):59-64)，其中，酶促活性單體A亞基StxA(具有32kDa的分子量)與負責結合細胞表面受體的B亞基StxB非共價締合。StxB是一個同五聚體蛋白(相同單體的五聚體，各單體具有7.7kDa的分子量)。StxB形成具有中央孔的環狀結構，StxA的羧基末端插入到其中(Fraser等，1994.NatStructBiol1(1):59-64)。StxA亞基和StxB亞基均被分泌到細菌周質中，在細菌周質中它們非共價組裝成全毒素，如最初描述的來自大腸桿菌的不耐熱腸毒素(Hirst等，1984.ProcNatlAcadSciUSA81(24):7752-6)。StxA具有高度特異性的RNAN-糖苷酶活性，切割位于真核生物核糖體的28S核糖體RNA(rRNA)VI結構域上的α-sarcin環上的4,324位的腺嘌呤堿基，從而抑制延伸因子依賴性的氨酰tRNA結合和隨后的鏈延長(Endo等，1988.EurJBiochem171(1-2):45-50)。細菌核糖體也是StxA的底物，并且，暴露于志賀毒素1型(Stx1)導致敏感細菌的增殖減少(Suh等，1998.Biochemistry37(26):9394-8)。StxA亞基由通過二硫橋連接的兩個片段組成，所述StxA亞基在胞質和內質網中由酶進行蛋白水解切割，從而生成27kDa的A1亞基(負責酶活性)并釋放出較小的A2片段(Garred等，1995.JBiolChem270(18):10817-21)。Austin和合作者顯示出，雖然StxA和StxB可在體外自發形成全毒素，重組A1片段不能結合StxB，這表明片段A2對全毒素的組裝至關重要(Austin等，1994.InfectImmun62(5):1768-75)。StxA負責毒性作用，而StxB五聚體負責結合真核細胞中的特異性受體。StxB結合中性糖鞘脂神經酰胺三己糖苷(globotriaosylceramide，Gb3；也稱為Cd77或Pk血型抗原)(Gb3存在于細胞表面上(Jacewicz等，1986.JExpMed163(6):1391-404；Lindberg等，1987.JBiolChem262(4):1779-85；Waddell等，1990.ProcNatlAcadSciUSA87(20):7898-901))，導致毒素隨后的內化(internalization)。在沒有StxA的情況下，StxB仍采用五聚體結構，在結合受體的能力方面該五聚體在功能上等同于全毒素(Donohue-Rolfe等，1989.MolMicrobiol3(9):1231-6)。每個B亞基單體包含兩個三鏈反向平行β折疊和一個α螺旋。所述五聚體形成具有直徑為約的中央孔的環狀結構，該環狀結構由五個α螺旋界定并被來自成對的相鄰單體的β折疊包圍，形成六鏈反向平行β折疊(Stein等，1992.Nature355(6362):748-50)。與受體Gb3三糖類似物復合的志賀毒素1的B亞基(Stx1B)的晶體結構解析揭示了B亞基的各單體內的三個潛在結合位點(稱為位點1、位點2和位點3)(Ling等，1998.Biochemistry37(7):1777-88)。因此，在StxB五聚體中有15個Gb3結合位點。所有15個Gb3結合位點面向相同方向，遠離A亞基，從而鑒定出五聚體中的膜相互作用表面。無論是直接地還是經由構象變化，Gb3結合位點彼此均不相互作用。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含與志賀毒素2型的B亞基的單體具有至少95％的氨基酸序列一致性的肽，所述肽與布魯氏菌屬2,4?二氧四氫蝶啶合酶的單體直接融合或通過肽接頭融合。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2013.05.27 US 61/827,7131.一種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含與志賀毒素2型的B亞基的單體具有至少95％的氨
基酸序列一致性的肽，所述肽與布魯氏菌屬2,4-二氧四氫蝶啶合酶的單體直接融合或通過
肽接頭融合。
2.如權利要求1所述的嵌合蛋白，其中，所述肽與布魯氏菌屬2,4-二氧四氫蝶啶合酶的
單體的N末端直接融合或通過肽接頭融合。
3.如權利要求1或2所述的嵌合蛋白，其中，所述布魯氏菌屬2,4-二氧四氫蝶啶合酶的
單體與SEQIDNo.:9具有至少95％的序列一致性。
4.如權利要求1-3中任一項所述的嵌合蛋白，其中，所述布魯氏菌屬2,4-二氧四氫蝶啶
合酶的單體在前8個N末端氨基酸位置內具有一個或多個替換、刪除和/或插入，使得刪除和
插入的組合并未導致相對于SEQIDNo.:9而言延長超過5個氨基酸。
5.如權利要求1-4中任一項所述的嵌合蛋白，其中，所述志賀毒素2型的B亞基的單體與
所述布魯氏菌屬2,4-二氧四氫蝶啶合酶的單體的N末端通過肽接頭連接。
6.如權利要求5所述的嵌合蛋白，其中，所述肽接頭為G/S柔性肽。
7.如權利要求5或6所述的嵌合蛋白，其中，所述肽接頭的長度為2-20個氨基酸。
8.如權利要求7所述的嵌合蛋白，其中，所述肽接頭的長度為5-15個氨基酸。
9.如權利要求8所述的嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含選自于由以下氨基酸序列所組成
的組中的氨基酸序列：SEQIDNo:3、SEQIDNo:5和SEQIDNo:7。
10.如權利要求9所述的嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含氨基酸序列SEQIDNo:5。
11.包含權利要求1-10中任一項所述的嵌合蛋白的五聚體的二聚物的蛋白寡聚復合
體。
12.編碼權利要求1-10中任一項所述的嵌合蛋白的多核苷酸。
13.如權利要求12所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含選自于由以下核苷酸序列所組
成的組中的核苷酸序列：SEQIDNo:4、SEQIDNo:6和SEQIDNo:8。
14.如權利要求13所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含核苷酸序列SEQIDNo:6。
15.包含權利要求12所述的多核苷酸的載體。
16.如權利要求15所述的載體，所述載體包含選自于由以下核苷酸序列所組成的組中
的核苷酸序列：SEQIDNo:4、SEQIDNo:6和SEQIDNo:8。
17.如權利要求12所述的載體，所述載體包含核苷酸序列SEQIDNo:6。
18.包含權利要求12所述的多核苷酸的轉基因細胞。
19.如權利要求18所述的轉基因細胞，其中，所述細胞為大腸桿菌細胞、哺乳動物細胞
或巴斯德畢赤酵母細胞。
20.如權利要求19所述的轉基因細胞，其中，所述細胞為大腸桿菌BL21(DE3)細胞。
21.如權利要求19所述的轉基因細胞，其中，所述細胞為哺乳動物293T細胞。
22.如權利要求19所述的轉基因細胞，其中，所述細胞為巴斯德畢赤酵母細胞。
23.包含權利要求11所述的蛋...

【專利技術屬性】
技術研發人員：馬丁·迭戈·萊納斯·施帕茨，費爾南多·阿爾貝托·哥德巴姆，瓦妮莎·孜勒比曼，帕特里西·奧利弗·克雷格，吉塞爾·蓋爾斯，瑪麗娜·桑德拉·巴勒莫，瑪麗亞·皮拉爾·梅希亞斯，萊蒂西亞·維羅妮卡·本坦科，
申請(專利權)人：英母拓公司，馬丁·迭戈·萊納斯·施帕茨，
類型：發明
國別省市：阿根廷;AR