去除殘留細(xì)胞培養(yǎng)雜質(zhì)制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了用于從蛋白質(zhì)制備物中去除殘留雜質(zhì)的方法。這類方法包括在非沉淀?xiàng)l件下向包含感興趣的蛋白質(zhì)和細(xì)胞污染物的溶液中加入陰離子去污劑并將該溶液通過離子交換柱。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】相關(guān)申請本國際專利申請要求2013年11月15日提交的美國臨時(shí)申請61/904,747和2013年12月20日提交的歐洲申請13199257.0的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容在此通過引用全文納入本文。專利
本專利技術(shù)涉及在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)蛋白質(zhì)及其改善的純化方法。
技術(shù)介紹
已經(jīng)預(yù)先描述了用于在細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)疫苗和其它生物制劑的各種方法。如果使用連續(xù)細(xì)胞系來進(jìn)行生產(chǎn)，則存在細(xì)胞系的殘留DNA可能有致癌性的風(fēng)險(xiǎn)。因此需要從感興趣的治療性蛋白質(zhì)中破壞并去除殘留DNA。對于病毒疫苗，F(xiàn)DA最近推薦低于10ng/劑的DNA的量和低于200個(gè)堿基對的片段尺寸(《工業(yè)指南：用于生產(chǎn)針對感染性適應(yīng)癥的病毒疫苗的細(xì)胞基質(zhì)和其它生物材料的表征和資質(zhì)》(GuidanceofIndustry.CharacterizationandQualificationofCellSubstratesandotherBiologicalMaterialsUsedintheProductionofViralVaccinesforInfectionsDiseaseIndications).FDA/CBER2010年2月；可從以下下載：http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/vaccines/ucm202439.pdf)。<br>已經(jīng)描述了幾種用于從細(xì)胞培養(yǎng)衍生的疫苗中去除殘留DNA的方法。美國專利5,948,410描述了用于從細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)流感疫苗的方法，其中DNA酶處理與使用CTAB的裂解步驟結(jié)合。WO2007/052163描述了用于從細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)流感疫苗的方法，其中使用β-丙內(nèi)酯(BPL)來滅活病毒并降解殘留DNA。然后，例如，通過用CTAB處理來裂解病毒。然后從病毒制備物中去除片段化的DNA。無論如何，仍然需要進(jìn)一步改進(jìn)從流感病毒制備物或從連續(xù)細(xì)胞系中產(chǎn)生的其它感興趣產(chǎn)物中去除殘留細(xì)胞DNA。US2012-0101262中已經(jīng)公開了辛酸與離子交換色譜聯(lián)用來從細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的抗體中去除細(xì)胞DNA。然而，US2012-0101262需要在誘導(dǎo)殘留DNA沉淀并污染蛋白質(zhì)(具體是低pH下)的條件下使用辛酸。然后，可分離沉淀物和感興趣的蛋白質(zhì)，并且后者通過離子交換色譜進(jìn)一步純化。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了使用辛酸或辛酸鹽從細(xì)胞培養(yǎng)物中去除雜質(zhì)和聚集體的多種其它方法。Steinbuch(Steinbuch,M.等，Arch.Biochem.Biophys.134:279-94(1969))描述了通過對其中無包膜和包膜病毒的辛酸鹽沉淀從人血漿中回收IgG。美國專利7,553,938描述了通過在pH4.6至約4.95下加入辛酸根或庚酸根離子從起始溶液中純化抗體并且將該溶液過濾通過至少一種陰離子交換樹脂。美國專利5,886,154描述了從人血漿中純化抗體的過程，包括在pH3.8至4.5下懸浮抗體，之后在pH5.0至5.2下加入辛酸以沉淀污染蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，同時(shí)抗體保留在溶液中。抗體純化中采用辛酸，因?yàn)槎讨舅崤cα球蛋白和β球蛋白在酸性pH下形成不溶性復(fù)合物，其中γ球蛋白不易于沉淀(Chanutin等，1960)。因此，可易于分離γ球蛋白。但是，這些公開都沒有教導(dǎo)或啟示使用陰離子去污劑來在防止本文所述的沉淀的條件下從病毒蛋白質(zhì)中去除殘留DNA。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)涉及制備蛋白質(zhì)及其改善的純化方法。具體地，本專利技術(shù)提供了從合適宿主(例如，宿主細(xì)胞)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)物中去除細(xì)胞污染如殘留核酸的方法。因此，本專利技術(shù)也包括通過這類方法制備的相關(guān)組合物。本專利技術(shù)因此包括增加從細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的生物產(chǎn)品的產(chǎn)率、純度和/或安全性的方法。通過本專利技術(shù)的方法制備的生物產(chǎn)品可包括，但不限于：生物藥物、蛋白質(zhì)、多糖、病毒抗原和抗體。在一個(gè)具體方面中，本專利技術(shù)提供了基本沒有殘留DNA的生物產(chǎn)品。專利技術(shù)人已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)通過向包含蛋白質(zhì)和細(xì)胞DNA的溶液中加入陰離子去污劑，之后進(jìn)行包括離子交換基質(zhì)的純化步驟顯著改善了對包含源自細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)和DNA的樣品的純化。待解決的問題可能涉及在帶正電的離子交換基質(zhì)中從感興趣的蛋白質(zhì)中分離帶負(fù)電的DNA雜質(zhì)的低效。可以假定次級相互作用在減少陰離子交換色譜吸附帶負(fù)電的DNA雜質(zhì)的能力上起到作用。本專利技術(shù)現(xiàn)在通過用陰離子去污劑溶液接觸殘留DNA并通過在陰離子交換基質(zhì)上吸附來處理殘留DNA實(shí)現(xiàn)了富集的產(chǎn)物及其增加的產(chǎn)率。專利技術(shù)人意外地發(fā)現(xiàn)本專利技術(shù)也去除了流感病毒核蛋白。通過本專利技術(shù)實(shí)現(xiàn)的污染物的高效去除能有更高的產(chǎn)品產(chǎn)率，因?yàn)榭稍黾臃跤透腥敬螖?shù)使得可以得到更高量的感興趣蛋白質(zhì)。本專利技術(shù)也包括以下認(rèn)識，即如果在陰離子去污劑如脂肪酸去污劑(例如，辛酸鈉)存在下通過離子交換色譜純化病毒制備物，可實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的流感病毒中特別有效地去除殘留DNA。令人驚訝地，專利技術(shù)人也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本文所述的方法基本去除流感病毒核蛋白(NP)。優(yōu)選地，如果需要去除NP，本專利技術(shù)并不限于源自細(xì)胞培養(yǎng)物的流感病毒，但也可應(yīng)用于在雞蛋中產(chǎn)生的流感病毒。與本領(lǐng)域所述的方法不同(參見上述“背景”)，本專利技術(shù)在不沉淀感興趣的蛋白質(zhì)或DNA的條件下采用陰離子去污劑。根據(jù)本專利技術(shù)，通過陰離子交換色譜從污染DNA/蛋白質(zhì)中分離來制備感興趣的蛋白質(zhì)。通過使用本文所述的方法，可顯著降低樣品中雜質(zhì)(例如，殘留DNA)的量。可使用本專利技術(shù)來從含在宿主細(xì)胞，如細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的一種或多種感興趣蛋白質(zhì)的任意樣品中去除殘留細(xì)胞DNA。因此，本專利技術(shù)提供了一種用于從包含在宿主細(xì)胞，如細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的感興趣蛋白質(zhì)的樣品中去除殘留細(xì)胞DNA的方法，包括在非沉淀?xiàng)l件下向包含感興趣的蛋白質(zhì)的溶液中添加陰離子去污劑并且將該溶液通過離子交換基質(zhì)以去除殘留細(xì)胞DNA。本專利技術(shù)的方法并不受到特定感興趣蛋白的限制。可按照本專利技術(shù)純化的蛋白質(zhì)的非限制性示例包括，但不限于：治療性蛋白質(zhì)、抗原(例如，免疫原性蛋白質(zhì))、抗體或其片段。根據(jù)本專利技術(shù)，可經(jīng)過本專利技術(shù)提供的方法的合適起始物質(zhì)可以是包含感興趣蛋白質(zhì)的溶液。該溶液可以是粗制細(xì)胞或組織制備物、部分純化的制備物、細(xì)胞在其中生長的培養(yǎng)基、或細(xì)胞培養(yǎng)上清等，但可能含有需要去除的殘留細(xì)胞污染物。感興趣的蛋白質(zhì)可在合適的宿主細(xì)胞系統(tǒng)中生長并且可通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)分離技術(shù)從細(xì)胞雜質(zhì)中純化或澄清。任選地，可在將本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種從包含感興趣的蛋白質(zhì)的樣品中去除殘留細(xì)胞DNA的方法，所述方法包括以下步驟：a.在非沉淀?xiàng)l件下向包含感興趣的蛋白質(zhì)的溶液加入陰離子去污劑；和b.將所述溶液通過離子交換基質(zhì)，從中所述殘留細(xì)胞DNA結(jié)合至離子交換樹脂，以獲得包含所述感興趣的蛋白質(zhì)的洗脫液，其中所述洗脫液基本沒有細(xì)胞DNA。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2013.11.15 US 61/904,7471.一種從包含感興趣的蛋白質(zhì)的樣品中去除殘留細(xì)胞DNA的方法，
所述方法包括以下步驟：
a.在非沉淀?xiàng)l件下向包含感興趣的蛋白質(zhì)的溶液加入陰離子去污劑；
和
b.將所述溶液通過離子交換基質(zhì)，從中所述殘留細(xì)胞DNA結(jié)合至離
子交換樹脂，以獲得包含所述感興趣的蛋白質(zhì)的洗脫液，其中所述洗脫液
基本沒有細(xì)胞DNA。
2.一種從包含病毒蛋白質(zhì)的樣品中去除殘留細(xì)胞DNA的方法，所述
方法包括以下步驟：
a.提供包含宿主細(xì)胞系統(tǒng)中生長的病毒的樣品，其中所述病毒表達(dá)感
興趣的病毒蛋白質(zhì)；
b.裂解所述病毒；
c.在非沉淀?xiàng)l件下向包含所述病毒蛋白質(zhì)的溶液加入陰離子去污劑；
和
d.將所述溶液通過離子交換基質(zhì)，從中殘留細(xì)胞DNA結(jié)合至離子交
換樹脂，以獲得包含所述感興趣的病毒蛋白質(zhì)的洗脫液。
3.一種制備流感病毒疫苗組合物的方法，所述組合物包含源自細(xì)胞培
養(yǎng)物上增殖的病毒的免疫原性蛋白質(zhì)，所述方法包括以下步驟：
a.在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長病毒，
b.在非沉淀?xiàng)l件下向包含所述免疫原性蛋白質(zhì)的溶液加入脂肪酸去
污劑，和
c.在離子交換基質(zhì)上處理所述免疫原性蛋白質(zhì)。
4.一種從包含感興趣的病毒蛋白質(zhì)的制備物中去除流感病毒核蛋白
(NP)的方法，所述方法包括以下步驟：
a.裂解從細(xì)胞培養(yǎng)物或雞蛋中衍生的病毒制備物，
b.在非沉淀?xiàng)l件下向所述病毒制備物加入陰離子去污劑，和
c.使所述病毒制備物通過離子交換基質(zhì)，從中所述核蛋白結(jié)合至所述
離子交換基質(zhì)。
5.如權(quán)利要求1-4所述的方法，其特征在于，所述方法還包括澄清步
驟。
6.如權(quán)利要求1-4所述的方法，其特征在于，所述方法還包括濃縮步
驟。
7.如權(quán)利要求1-4所述的方法，其特征在于，所述方法還包括深度過
濾步驟。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在去污劑
步驟(b)之前的裂解步驟。
9.如權(quán)利要求2-4所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在離子
交換步驟之前的滅活步驟。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述裂解步驟包括用
CTAB處理。
11.如前...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：C·諾曼，E·蘇達(dá)，K·道利斯，R·埃斯提加拉加，P·巴斯泰克，V·耶農(nóng)，
申請(專利權(quán))人：諾華股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：瑞士;CH