一種水貂綠膿桿菌滅活疫苗制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種水貂綠膿桿菌滅活疫苗，包括有抗原和疫苗佐劑，其中使用的抗原為B型水貂綠膿桿菌LN03株，保藏編號(hào)為CCTCC?NO：M2016068。本發(fā)明專利技術(shù)制備滅活疫苗安全可靠，能提供有效地同源攻毒保護(hù)，免疫后能夠產(chǎn)生較強(qiáng)免疫力，接種貂群的發(fā)病率和死亡率均明顯減少，能夠有效預(yù)防水貂出血性肺炎的流行和傳播，降低本病對(duì)毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失，有著廣闊的應(yīng)用前景。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于疫苗制備
，具體涉及一種水貂綠膿桿菌滅活疫苗。
技術(shù)介紹
水貂出血性肺炎又稱水貂假單胞菌性肺炎，是主要發(fā)生在每年8-11月份水貂換毛 季節(jié)的一種急性傳染病，以出血性肺炎、急性死亡為特征，死前出現(xiàn)呼吸困難、鼻孔流出紅 色帶泡沫液體等癥狀，死后剖檢可見整個(gè)肺葉腫大并有彌漫性出血和敗血癥變化。本病世 界各地均有發(fā)生，每年可造成養(yǎng)殖場(chǎng)20 %-40 %的死亡率，是危害毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的重要細(xì) 菌性傳染病。 該病病原為假單胞菌科(Pseudomonadaceae)假單胞菌屬(Pseudomonas)中的銅綠 假單胞菌（Pseudomonas aeruginolsa)，亦稱為綠胺桿菌（Bacterium pyocyaneum)，為革蘭 氏陰性桿菌，兩端鈍圓，一端有一根鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。不能形成芽孢及莢膜。在普通瓊脂培養(yǎng)基 上生長(zhǎng)良好，形成大小不一的菌落。多數(shù)能產(chǎn)生色素，使菌落周圍瓊脂培養(yǎng)基著色。綠膿桿 菌共有六3、(：、04、？、6、!1、1、6、1(^、~等14個(gè)血清型。我國(guó)各地水貂出血性肺炎的流行血 清型主要以G(6型）、B(2、5、16型)為主(括號(hào)內(nèi)為對(duì)應(yīng)的國(guó)際血清分型系統(tǒng)IATS)。 水貂出血性肺炎發(fā)病急，死亡快，發(fā)病時(shí)往往來不及治療，常用藥物替米考星、阿 奇霉素、卡那霉素治療效果不顯著，而且抗生素的濫用導(dǎo)致綠膿桿菌已產(chǎn)生耐藥性，因此需 要有效的疫苗來預(yù)防，國(guó)外有報(bào)道將細(xì)菌細(xì)胞壁提取物(JAMES E.PENNINGTON，1979)加類 毒素成分彈性蛋白酶制成免疫原，有一定的免疫效果，但制備過程復(fù)雜，成本高，不適合大 量生產(chǎn)使用，而且免疫次數(shù)多，免疫期短，不適合臨床應(yīng)用，綠膿桿菌抗原型繁多，單一成分 的細(xì)胞提取物往往很難達(dá)到很好的保護(hù)效果。目前各國(guó)在水貂出血性肺炎的預(yù)防中多以菌 體滅活疫苗產(chǎn)品為主，將流行血清型的菌株滅活后制備成多價(jià)滅活疫苗，可有效預(yù)防同類 血清型菌株引起的該病。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種水貂綠膿桿菌滅活疫苗，從而解決水貂綠膿桿菌滅活疫 苗研發(fā)中現(xiàn)有疫苗株免疫原性不強(qiáng)、各血清型之間免疫交叉保護(hù)力低的問題。 本專利技術(shù)的一種水貂綠膿桿菌滅活疫苗，包括有抗原和疫苗佐劑，其中使用的抗原 為13型水紹綠胺桿菌(？8611(1〇1]1〇11&8&61'1^;[1118&)1^03株，該菌株于2016年2月22日保藏在中 國(guó)武漢、武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2016068。 上述的水貂綠膿桿菌是用甲醛進(jìn)行滅活的； 優(yōu)選佐劑為蜂膠佐劑或水佐劑； 所述的疫苗中含菌量2 4.0 X 109CFU/mL。 本專利技術(shù)制備的滅活疫苗安全可靠，能提供有效地同源攻毒保護(hù)，免疫后能夠產(chǎn)生 較強(qiáng)免疫力，接種貂群的發(fā)病率和死亡率均明顯減少，能夠有效預(yù)防水貂出血性肺炎的流 行和傳播，降低本病對(duì)毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失，有著廣闊的應(yīng)用前景。【具體實(shí)施方式】 為了更好的理解本專利技術(shù)，下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明。 本專利技術(shù)具體實(shí)施例所使用的培養(yǎng)基如下： 生產(chǎn)用培養(yǎng)基：十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基(NAC)配制：稱取4g NAC粉末加入100mL蒸餾水 中，充分混勻后，121°C滅菌15min，冷卻至50 °C~60 °C時(shí)，傾倒平板備用。 改良營(yíng)養(yǎng)普通肉湯培養(yǎng)基(NB)配制：稱取5g NB粉末加入100mL蒸餾水中，121°C滅 菌15min。臨用前加入終濃度2%胎牛血清的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，混合均勻后配制而成。發(fā)酵培養(yǎng)基配制:蛋白胨2%，牛肉膏0.6%，氯化鈉0.5%，葡萄糖0.5%，用去離子 水配成，配完調(diào)?11值7.4~7.6，1121€3〇1^11，滅菌后按照培養(yǎng)基的2%加入健康胎牛血清。 實(shí)施例1: 1.1綠膿桿菌菌株的分離純化方法 從遼寧省疑似水貂出血性肺炎的某大型水貂養(yǎng)豬場(chǎng)選取發(fā)病水貂，無菌采集病貂 的肺臟、肝臟和心血?jiǎng)澗€接種于十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基(NAC)上，置于37°C培養(yǎng)箱 培養(yǎng)16h~18h，挑取圓形、光滑、濕潤(rùn)、扁平的菌落革蘭氏染色鏡檢，選取革蘭氏陰性細(xì)小桿 菌進(jìn)行劃線純培養(yǎng)。 將純培養(yǎng)菌株分別劃線接種于鮮血瓊脂平板和NAC平板，37°C培養(yǎng)16h~18h，選取 在十六烷三甲基溴化銨培養(yǎng)基上產(chǎn)生綠色熒光色素，在血瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生β溶血的小菌 落進(jìn)行純化培養(yǎng)。 根據(jù)綠膿桿菌的生化鑒定試驗(yàn)要求進(jìn)行鑒定，將進(jìn)一步純化培養(yǎng)的兩株菌株，分 別進(jìn)行綠膿色素培養(yǎng)基生長(zhǎng)、氧化酶試驗(yàn)、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、木糖分解試驗(yàn)、硝 酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、42°C生長(zhǎng)試驗(yàn)等。結(jié)果均為表1所示。該菌株根據(jù)其病貂的來 源地命名為L(zhǎng)N03株。表1分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果 1.2 16S rRNA基因序列測(cè)定與分析 1 · 2 · 1 引物設(shè)計(jì)采用細(xì)菌的 16S rRNA通用引物F27 (5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '）和下游引物R1492(5 ' -TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3 '）。引物送由上海生物工程技術(shù)服務(wù) 有限公司合成。引物由上海生物工程有限公司合成。 1.2.2細(xì)菌DNA模板的制備過夜培養(yǎng)綠膿桿菌，取lml菌液到1.5mlEP管中，8000r/ min lOmin倒掉上清，沉淀用100μΙ蒸餾水懸浮，沸水煮沸15min，放在-20°C冰柜反復(fù)凍融3 次。5000r/min lOmin，收集上清即為細(xì)菌基因組DNA。 1.2.3PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增體系總體積為25yL，10XEx Taq Buffer 2.5yL、dNTPs 2μ L、上下游引物（ΙΟμL?θΙ/L)各0.5yL、模板DNA lyL、Ex Taq DNA聚合酶0.25yL，ddH20 18·25μ LoPCR 擴(kuò)增條件：941€5111丨11;94°(：1111丨11，53°(：1111丨11，72 1€2111丨11，循環(huán)30次；72°(：延伸1511^11。 1.2.4凝膠電泳將PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液后，用1 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，然后用凝 膠成像儀分析結(jié)果。經(jīng)測(cè)定B型LN03株的16SrRNA基因片段大小為1524bp。用DNA快速回收試 劑盒回收PCR產(chǎn)物，_20°C保存?zhèn)溆谩?1.2.5 16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆與測(cè)序?qū)⒒厥盏腜CR產(chǎn)物與pMD19-T在16°C連接 30min，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌，37°C過夜培養(yǎng)12h~16h。挑取平板上的單菌落于氨芐青霉素 抗性的LB液體培養(yǎng)基中37 °C過夜振蕩培養(yǎng)，次日應(yīng)用菌液PCR的方法擴(kuò)增16SrRNA基因篩選 陽(yáng)性克隆，鑒定為陽(yáng)性的菌液提取質(zhì)粒交由青島華大基因科技股份有限公司測(cè)序。將序列 在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，與已發(fā)布的綠膿桿菌相應(yīng)序列的同源性最高。 1.3綠膿桿菌LN03株的血清學(xué)鑒定綠膿桿菌血清分型按日本生研株式會(huì)社銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清試劑盒附帶 的說明書進(jìn)行操作： 1.3.1抗原的制備將被檢菌株劃線接種于NAC培養(yǎng)基上，置37°C培養(yǎng)24小時(shí)，再挑 取單個(gè)菌落接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24小時(shí)。取單個(gè)菌落溶于100yL生理鹽水， 置于EP管中，制成抗原備用。 1.3.2玻板凝本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種水貂綠膿桿菌滅活疫苗，其特征在于，所述的滅活疫苗包含有抗原和疫苗佐劑，其中抗原為滅活的B型水貂綠膿桿菌(Pseudomonas?aeruginlsa)LN03株。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：單虎，張洪亮，蓋春云，黃娟，張傳美，秦志華，楊瑞梅，秦曉冰，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：山東;37