一種紫花杯冠藤組培快繁的方法技術

本發明專利技術涉及一種紫花杯冠藤組培快繁的方法，屬于組織培養領域，包括以下步驟：外植體的選擇及處理、外植體的消毒、接種培養、繼代增殖培養、生根培養。本發明專利技術培養方法速度快，再生頻率較高，擴繁系數高達40倍以上，并且變異率較低，周期相對較短，能較好地保持紫花杯冠藤的遺傳穩定性。培養的組培苗移栽成活率高，達到85％以上。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于組織培養
，具體涉及。
技術介紹
紫花杯冠藤(Cynanchumpurpureum)是蘿蘑科鸛絨藤屬的植物，分布在俄羅斯、朝鮮以及中國大陸的河北等地，生長于海拔100米至670米的地區，一般生長在山地林中，屬于直立草本植物，略為分枝而互生，莖被疏長柔毛，干后中空。花期5-6月，果期6月。絨藤屬植物在抗腫瘤、免疫調節、抗氧化以及鎮痛、鎮靜、抗炎等方面具有較高的藥用價值，很早就有人從中分離出C21留體類、留體類生物堿、黃酮類、萜類、苯類衍生物以及脂肪烷和脂肪酸類化合物等多種化學成分;對開發新藥和尋找新藥源都具有很大的現實意義。目前對于紫花杯冠藤的研究較少，更沒有關于紫花杯冠藤組織培養方面的研究。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供，能夠快速建立起紫花杯冠藤的組培快繁體系，可以實現紫花杯冠藤的快速增殖。為了實現上述目的，本專利技術提供如下技術方案:—種紫花杯冠藤組培快繁的方法，包括如下步驟:(I)外植體的選擇及處理:選用帶有腋芽的野外植株，用干凈的剪刀剪下帶有2個腋芽的莖段，把莖段用干凈的封口袋保存，保存時間不超過兩天并且不能沾水；(2)外植體的消毒:把步驟(I)得到的莖段放在燒杯中，先加入2?4滴洗潔精，再加水沖洗2?3次至無泡沫，沖洗時間不能過長以免造成二次污染，然后將其在超凈臺中先用體積濃度70 %的酒精浸0.5?2分鐘，無菌水沖洗2?4次，用加兩滴吐溫的質量濃度為5 %的次氯酸鈉溶液消毒3?7分鐘后用無菌水洗4?6次;再用加兩滴吐溫的質量濃度0.1 %的升萊消毒5?15分鐘，后用無菌水洗5?6次；(3)接種培養:將莖段剪成Icm左右的小段，每段帶兩個腋芽，將其接種到接種培養基上;(4)繼代增殖培養:接種成功后將分化的芽接種到繼代增殖培養基上進行繼代增殖，每次繼代30天左右；(5)生根培養:將經過繼代培養的分化芽轉移到生根培養基上誘導生根。步驟(3)所述的接種培養基為MS+6-BA0.05mg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g/L。步驟(4)所述的繼代增殖培養基為MS+6-BA lmg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g/L。步驟(5)所述的生根培養基為1/2MS+IBA 0.1?0.2mg/L+糖20g/L。步驟(4)所述的繼代增殖培養，如在繼代過程中苗有細弱現象，則用權利要求3所述的繼代增殖培養基和MS+6-BA 0.05mg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g//L培養基交替使用培養以達到壯苗目的，每30天更換一次。優選地，步驟(3)、(4)和(5)的培養條件均為:23土 TC，光照時間12小時/天，光照強度2000Lx左右，pH值為6.2。優選地，還包括組培苗移栽，具體如下:組培苗根長出2?3cm時出瓶，出瓶前練苗一周，先將培養瓶移至溫室，自然條件下煉苗2d，然后解開封口膜，煉苗5d，煉苗完成后取出小苗洗凈根部附著的培養基，用多菌靈1000倍液或百菌清1000倍液清洗并浸泡幼苗根部，防止病害的發生，移栽到經消毒的栽培基質中，溫度控制在24-26°C，濕度控制在70%左右，15d以后逐漸降低濕度，直至將移栽苗置于自然條件下，煉苗移栽期間適當遮光，使光照強度為自然光的50%。優選地，所述的栽培基質用腐殖土、園土和沙按照I: 1:1的體積比混合而成。優選地，步驟(2)所述外植體的消毒方法為:把步驟(I)得到的莖段放在燒杯中，先加入3滴洗潔凈，再加水沖洗3次至無泡沫，然后將其在超凈臺中先用體積濃度70%的酒精浸I分鐘，無菌水沖洗2次，用加入兩滴吐溫的質量濃度為5%的次氯酸鈉消毒5分鐘后用無菌水洗5次;再用加入兩滴吐溫的質量濃度0.1 %的升汞消毒10分鐘，后用無菌水洗6次。本專利技術的有益效果是:本專利技術通過系統的研究，對紫花杯冠藤各個培養階段的培養基進行了優選，首次建立了紫花杯冠藤的組織培養體系，提供了一整套的采用紫花杯冠藤的莖段作為外植體進行培養的方法，可以生產整齊一致的紫花杯冠藤幼苗，為紫花杯冠藤的快速繁殖提供了有效的支持，為紫花杯冠藤的開發利用提供了技術保證，也為進一步探索紫花杯冠藤的基因工程、拓寬外植體材料等奠定了基礎。并且本專利技術培養過程速度快，再生頻率較高，擴繁系數高達40倍以上，并且變異率較低，周期相對較短，能較好地保持紫花杯冠藤的遺傳穩定性。培養的組培苗移栽成活率高，達到85%以上。【附圖說明】圖1是本專利技術紫花杯冠藤經過繼代增殖培養出來的苗生長狀況。圖2是本專利技術紫花杯冠藤的生根情況。圖3是生根培養基激素過量時紫花杯冠藤的生長狀況。【具體實施方式】下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1—種紫花杯冠藤組培快繁的方法，包括如下步驟:(I)外植體的選擇及處理:選用帶有腋芽的野外植株，野外采集外植體應避免二次污染，用干凈的剪刀剪下帶有2個腋芽的莖段，把莖段用干凈的封口袋保存，保存時間不超過兩天并且不能沾水；(2)外植體的消毒:把步驟(I)得到的莖段放在燒杯中，先加入3滴洗潔精，再加水沖洗3次至無泡沫，然后將其在超凈臺中先用體積濃度為70%的酒精浸I分鐘，無菌水沖洗2次，用加入兩滴吐溫的有效氯濃度為5%的次氯酸鈉消毒5分鐘后用無菌水洗5次;再用加入兩滴吐溫的質量濃度0.1 %的升汞消毒10分鐘，后用無菌水洗6次。(3)接種培養:將莖段剪成Icm左右的小段，每段帶兩個腋芽，將其接種到接種培養基(MS+6-BA0.05mg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g/L)上;培養約2_5天左右開始生長；(4)繼代增殖培養:接種成功后將分化的芽接種到繼代增殖培養基(MS+6-BAlmg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g/L)上進行繼代增殖，每次繼代30天左右;生長情況見圖1，從圖1可以看出，經過繼代增殖的紫花杯冠藤生長狀況良好，增殖系數平均超過40。(5)生根培養:將經過繼代培養的分化芽轉移到生根培養基(1/2MS+IBA 0.lmg/L+糖20g/L)上誘導生根，約20天左右生根，經過30天左右，其生根情況如圖2所示，從圖2可以看出，其生根狀況良好，可以繼續進行組培苗的移栽。(6)組培苗移栽:組培苗根長出2?3cm時出瓶，出瓶前練苗一周，先將培養瓶移至溫室，自然條件下煉苗2d，然后解開封口膜，煉苗5d，煉苗完成后取出小苗洗凈根部附著的培養基，用多菌靈1000倍液或百菌清1000倍液清洗并浸泡幼苗根部，防治病害的發生，移栽到經消毒的栽培基質(腐殖土、園土和沙按照1:1:1的體積比混合而成)中，溫度控制在24-26 0C，濕度控制在70 %左右，15d以后逐漸降低濕度，直至將移栽苗置于自然條件下，煉苗移栽期間適當遮光，使光照強度為自然光的50% ο最終的移栽成活率達89%。上述紫花杯冠藤組培快繁的方法中，步驟(3)、(4)和(5)的培養條件均為:23± I0C，光照時間12小時/天，光照強度2000Lx左右，pH值為6.2。實施例2—種紫花杯冠藤組培快繁的方法，包括如下步驟: (I)外植體的選擇及處理:選用帶有腋芽的野外植株，野外采集外植體應避免二次污染，用干凈的剪刀剪下帶有2個腋芽的莖段，把莖段用干凈的封口袋保存，保存時間不超過兩天并且不能沾水；(2)外植體的消毒:把步驟(I)本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種紫花杯冠藤組培快繁的方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)外植體的選擇及處理：選用帶有腋芽的野外植株，用干凈的剪刀剪下帶有2個腋芽的莖段，把莖段用干凈的封口袋保存，保存時間不超過兩天并且不能沾水；(2)外植體的消毒：把步驟(1)得到的莖段放在燒杯中，先加入2～4滴洗潔精，再加水沖洗2～3次至無泡沫，沖洗時間不能過長以免造成二次污染，然后將其在超凈臺中先用體積濃度70％的酒精浸0.5～2分鐘，無菌水沖洗2～4次，用加兩滴吐溫的質量濃度為5％的次氯酸鈉溶液消毒3～7分鐘后用無菌水洗4～6次；再用加兩滴吐溫的質量濃度0.1％的升汞消毒5～15分鐘，后用無菌水洗5～6次；(3)接種培養：將莖段剪成1cm左右的小段，每段帶兩個腋芽，將其接種到接種培養基上；(4)繼代增殖培養：接種成功后將分化的芽接種到繼代增殖培養基上進行繼代增殖，每次繼代30天左右；(5)生根培養：將經過繼代培養的分化芽轉移到生根培養基上誘導生根。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：孫國峰，李曉東，林秦文，王亮生，吳東啟，
申請(專利權)人：中國科學院植物研究所，
類型：發明
國別省市：北京;11