一種農作物病原體拮抗放線菌及其篩選和應用制造技術

本發明專利技術屬于微生物技術領域，公開了一種農作物病原體拮抗放線菌及其篩選和應用。所述農作物病原體拮抗放線菌屬于利迪鏈霉菌屬，保藏編號為：CCTCC?M?2016038。所述篩選方法，包括：（1）采用梯度稀釋法從土壤樣品中得到培養的放線菌；（2）采用瓊脂塊法篩選得到拮抗靶標菌的放線菌；（3）將所述放線菌恒溫培養得到放線菌發酵液；（4）將靶標菌制成含菌的PDA平板，采用牛津杯法測量抑菌圈直徑；（5）選取抑菌圈直徑大于20mm的所述放線菌。本發明專利技術通過抑制病原菌的生長繁殖，對植物病害起到防治的作用，該方法較化學農藥對植物病害的防治相比，效果顯著，對土壤無污染，利于無公害、綠色產品的生產。

【技術實現步驟摘要】
一種農作物病原體拮抗放線菌及其篩選和應用
本專利技術屬于微生物
，尤其涉及一種農作物病原體拮抗放線菌及其篩選和應用。
技術介紹
農用抗生素是指由微生物發酵產生、具有農藥的功能、應用于農業上防治病蟲草鼠等有害生物的次生代謝產物。按照作用功能來說，則可分為殺菌抗生素、除草抗生素和殺蟲抗生素。農用抗生素的應用和開發可以追溯20世紀40年代，最初是在發達國家隨著醫用抗生素的使用而發展起來的，如鏈霉素、灰黃霉素等，但由于其性能和成本與化學農藥相比，都不具備優勢，所以一直發展緩慢。20世紀50年代后，各國科研人員在微生物農藥的研究上開展了許多工作，這促進了農用抗生素在這一時期發展的較快。放線菌屬于原核生物界、厚壁菌門，因氣生菌絲呈放射狀而得名。從放線菌中篩選具有農用活性的抗生素一直是我國科技工作者的研究熱點。放線菌作為生防菌和用放線菌生產農用抗生素進行植物病害生物防治與傳統化學農藥相比具有諸多優點。鐮孢霉菌是農作物的重要病原體，是一類數量大、種類繁多的真菌，它可引起多種農作物腐爛和枯萎病，其中以大麻頂枯病和玉米穗腐病最為普遍。鐮孢霉菌代謝所產生的霉菌毒素也會污染農產品，其中單端孢霉烯族毒素污染糧食和飼料非常普遍，是食品安全的重大威脅，每年對種植業和養殖業造成巨大的經濟損失并且鐮孢霉菌污染農作物以及毒素的產生具有連續效應。厚垣鐮孢霉會造成多種嚴重的植物病害，大麻、大豆、頭花蓼等作物都會被其感染并引發病害。但是對于厚垣鐮孢霉產生的植物病害的防治、拮抗菌的篩選，鮮見報道。
技術實現思路
本專利技術的專利技術目的在于：針對上述存在的問題，提供一種農作物病原體拮抗放線菌及其篩選和應用。本專利技術采用的技術方案如下：一種農作物病原體拮抗放線菌，該菌命名為RS15，屬于利迪鏈霉菌屬（Streptomyceslydicus），其保藏編號為：CCTCCM2016038；保藏地點為：中國，武漢，武漢大學；中國典型培養物保藏中心，保藏時間為2016年1月14日。進一步地，所述篩選方法包括如下步驟：（1）采用梯度稀釋法從待分離的土壤樣品中得到培養的放線菌；（2）采用瓊脂塊法從所述培養的放線菌中篩選得到拮抗靶標菌的放線菌；（3）將所述具有拮抗靶標菌的放線菌接種到放線菌液體發酵培養基后，在28℃下恒溫培養6-10天，得到放線菌發酵液；（4）將所述靶標菌接種在PDA平板上，制成含菌的PDA平板，將已滅菌的牛津杯放置于平板中央，牛津杯中加入120-170μL放線菌發酵液上清液，恒溫培養后測量抑菌圈直徑；（5）選取抑菌圈直徑大于20mm的所述放線菌。進一步地，所述靶標菌為厚垣鐮孢霉。病原真菌和細菌均可以作為篩選放線菌的靶標菌，根據使用目的的不同，可以選取不同的靶標菌，本專利技術選取厚垣鐮孢霉作為靶標菌。進一步地，所述采用梯度稀釋法從待分離的土壤樣品中得到培養的放線菌，具體步驟為：取待分離的土壤樣品置于磷酸緩沖液中，并得到上清液；將所述上清液分成多份，分別稀釋至10-8、10-4和10-2梯度，得到不同濃度的樣品懸液；將所述不同濃度的樣品懸液分別涂在高氏一號培養基上，28℃恒溫培養3-10天，得到培養的放線菌。進一步地，步驟（4）所述靶標菌接種在PDA平板上前，還包括將靶標菌制成孢子含量為100-120個/mL的懸浮液，加0.5-1.5mL的所述孢子懸浮液到PDA培養基中，然后快速倒入培養皿中，制成含菌的PDA平板。本專利技術還提供一種含有所述的農作物病原體拮抗放線菌的組合物。本專利技術還提供一種農作物病原體拮抗放線菌以及所述的組合物在防治植物病害中的應用。進一步地，引起植物病害的病原菌為大麻頂枯病菌、玉米穗腐病菌、大豆鐮孢根腐病菌、黃瓜枯萎病菌或番茄枯萎病中的一種或幾種。更進一步地，將篩選得到的放線菌或其組合物的發酵液噴撒在植株的病害部位；或者以放線菌活體菌株或發酵液為有效成分用作農用抗生素制成抑菌肥料，并將抑菌肥料施加到植株的根部土壤中。綜上所述，由于采用了上述技術方案，本專利技術的有益效果是：本專利技術提供的農作物病原體拮抗放線菌，該菌屬于利迪鏈霉菌屬，在實驗室條件下，對于多種導致植物病害的病原菌，例如，厚垣鐮孢霉、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，有明顯的抑制效果；可以作為一種很好的抑菌微生物，用于殺死或者抑制導致植物發生病害的多種病原菌；進而對植物起到防護病害的作用，在具體的操作中，可將篩選得到的放線菌的發酵液噴撒在植株的病害部位；或者以放線菌活體菌株或發酵液為有效成分用作農用抗生素制成抑菌肥料，并將抑菌肥料施加到植株的根部土壤中，進而形成以病原菌為靶標，通過抑制病原菌生長繁殖的作用對植物病害起到防治的作用，該方法較傳統的化學農藥防治植物病害的防線相比，其防治效果顯著，對土壤無污染，利于無公害、綠色產品的生產。附圖說明本專利技術將通過例子并參照附圖的方式說明，其中：圖1是本專利技術已純化的利迪鏈霉菌RS15的菌株照片。圖2是本專利技術的利迪鏈霉菌RS15菌株發酵液對厚垣鐮孢霉的抑制效果圖。圖3是本專利技術的利迪鏈霉菌RS15菌株發酵液對金黃色葡萄球菌的抑制效果圖。圖4是本專利技術的利迪鏈霉菌RS15菌株發酵液對枯草芽孢桿菌的抑制效果圖。圖5是本專利技術的利迪鏈霉菌RS15培養10天后的照片。圖6是本專利技術的利迪鏈霉菌RS15在掃描電鏡（放大100倍）下的照片。圖7是本專利技術的利迪鏈霉菌RS15的16SrDNA的PCR產物電泳圖。圖8是Neighborjoining方法建立的RS15系統進化樹圖。具體實施方式本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。本說明書（包括任何附加權利要求、摘要）中公開的任一特征，除非特別敘述，均可被其他等效或具有類似目的的替代特征加以替換。即，除非特別敘述，每個特征只是一系列等效或類似特征中的一個例子而已。菌株RS15的分離、篩選本實施例使用的培養基包括如下幾種：（1）高氏一號培養基：可溶性淀粉20.0g，KNO31.0g，NaCl0.5g，K2HPO40.5g，MgSO·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL，pH7.2～7.4。（2）放線菌液體發酵培養基：可溶性淀粉5.0g，葡萄糖1.0g，蛋白胨0.2g，酵母膏0.2g，NaCl0.2g，MgSO·7H2O0.5g，K2HPO40.5g，黃豆餅粉20g，蒸餾水1000mL，pH7.2～7.4。（3）真菌培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA培養基）:馬鈴薯200.0g，葡萄糖20.0g，瓊脂15.0~20.0g，蒸餾水1000mL，pH自然。本專利技術的農作物病原體拮抗放線菌的篩選方法，包括如下步驟：（1）采用梯度稀釋法從待分離的土壤樣品中得到培養的放線菌，具體步驟為：取待分離的土壤樣品10g置于磷酸緩沖液中，并得到上清液；將所述上清液分成多份，分別稀釋至10-8、10-4和10-2梯度，得到不同濃度的樣品懸液；將所述不同濃度的樣品懸液分別涂在高氏一號培養基上，28℃恒溫培養3-10天，得到培養的放線菌。本專利技術的待分離的土壤樣品分別從廣西宜州市仁信藥廠附近，六妹村，懷遠等地采集。放線菌的分離過程主要通過上述步驟實現，將土壤置于磷酸緩沖液之后，土壤中的微生物就會溶解到緩沖液中，由于土壤中的微生物數量巨本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種農作物病原體拮抗放線菌，其特征在于：該菌屬于利迪鏈霉菌屬（Streptomyces?lydicus），其保藏編號為：CCTCC?M?2016038。

【技術特征摘要】
1.一種農作物病原體拮抗放線菌，其特征在于：該菌為利迪鏈霉菌（Streptomyceslydicus）RS15，保藏號為：CCTCCNO：M2016038。2.一種含有權利要求1所述的農作物病原體拮抗放線菌的組合物。3.權利要求1所述的農作物病原體拮抗放線菌或權利要求2所述的組合...

【專利技術屬性】
技術研發人員：覃擁靈，何海燕，盧福芝，
申請(專利權)人：河池學院，
類型：發明
國別省市：廣西;45