本發明專利技術公開了一種鯉魚原代肝細胞的提取和培養方法，適用于生物工程技術領域，選鯉魚進行解剖，無菌取肝臟并剪碎，用胰蛋白酶消化后經細胞篩過濾得細胞懸液，后經Percolll純化，加入含有鯉魚血清的培養液得到新的細胞懸液；用血小球計數板進行計數，再以最適培養條件鋪板法培養增殖，最后對得到的原代肝細胞多種方法鏡檢鑒定。本發明專利技術鯉魚原代肝細胞的純化和培養方法直接無菌取鯉魚肝臟，經Percolll純化肝細胞，經鑒定，確實得到了數量多、純度高的離體鯉魚原代肝細胞，并用鯉魚血清代替傳統培養基中的配牛血清，提高了所提取離體細胞的活力，為進一步開展鯉魚原代肝細胞毒理試驗及其他實驗打下基礎。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種生物材料提取和培養方法，特別是涉及一種魚類局部組織細胞的提取和培養方法，應用于生物工程
技術介紹
肝臟作為魚體最大的解毒和代謝器官，在營養物質的消化吸收和保障魚體健康方面起著重要作用。由于其復雜性與重要性，對魚類肝臟的研究歷來是魚類生物學的重點內容，成果涉及魚類解剖學、組織學、免疫學、生理學、病理學、毒理學、營養學等許多領域。由于體內肝臟毒性實驗需要的動物樣本量大、花費高昂，且實驗結果的敏感性和重復性較差，開展體外細胞實驗是解決這問題的方向。細胞培養最大的優勢就是由于擺脫了實驗動物整體存在時的局限性，通過建立細胞培養模型，可以提高實驗的可操作性、重復性和結果的準確性。與傳代肝細胞株相比，原代肝細胞能較好地保留和維持活體肝細胞的完整形態和代謝活性，突變和變異性小，可真實反應體內代謝情況。所以，原代肝細胞的培養為深入研究魚類肝臟提供了一個有用的平臺。鯉魚屬鯉科，Cyprinidae，是一種原產亞洲的淡水魚，在全國各地均有分布，是我國主要的養殖魚種之一。鯉魚具有很大的食用和觀賞價值，深受我國廣大消費者喜愛。所以作為我國水環境中典型魚種之一，鯉魚和人類聯系緊密，可以通過探索鯉魚自身受環境影響程度進而來評估環境對人類的影響。鑒于魚類肝臟在機體中的重要性，通過在體外模擬肝細胞的生長環境，研究有毒物質對其代謝功能的影響，能更直觀的體現出該有毒物質的代謝毒性，從而評價環境對魚體的影響。所以提取鯉魚原代肝細胞對進行環境毒理實驗具有十分重要的意義，但通過目前的方法提取的鯉魚原代肝細胞的純度和活性不夠理想。
技術實現思路
為了解決現有技術問題，本專利技術的目的在于克服已有技術存在的不足，提供一種鯉魚原代肝細胞的提取和培養方法，采用無菌剪取鯉魚肝臟，胰蛋白酶消化后經篩網過濾，經密度梯度離心后加入特定培養基中，得到鯉魚原代肝細胞。本專利技術鯉魚原代肝細胞的純化和培養方法，能實現利用多種方法經行鏡檢鑒定，能夠很好的保證離體肝細胞的純度和活力，從而能夠保證滿足以鯉魚肝細胞為實驗對象的環境激素毒理實驗及其他實驗的需要，并為進一步開展更深層次的鯉魚肝細胞毒理實驗打下基礎。為達到上述專利技術創造目的，采用下述技術方案：一種鯉魚原代肝細胞的提取和培養方法，選擇規格均勻、體格健壯的平均體重400-600g的鯉魚預養2周，然后，在無菌條件下進行如下過程：a．無菌取鯉魚肝臟和鯉魚肝臟預處理：用魚用麻醉劑將魚麻醉5分鐘后，用無菌注射器從尾靜脈抽血至魚腮微白，用剪刀從肛門處沿腹中線向前剪至下頜，再沿鰓蓋后緣剪至下頜，打開左側體壁肌肉，找到鯉魚肝臟所在位置，用高壓滅菌的解剖器具無菌取肝臟，并將之置于D-Hank’s平衡鹽工作液中，用D-Hank’s平衡鹽工作液清洗肝臟組織2-3次至肝臟發白，以洗去肝臟組織中殘留的血液，完成鯉魚肝臟預處理過程；b．機械破碎鯉魚肝臟和對鯉魚肝臟和消化處理：將在所述步驟a中選取和經過預處理的鯉魚肝臟剪碎成約1mm×1mm塊狀，再用D-Hank’s平衡鹽工作液清洗肝臟組織塊至少1次，然后加入塊狀鯉魚肝臟的10倍體積的0.25%胰酶，在在25℃條件下進行40min消化處理，在消化期間不斷轉動肝臟組織，消化處理后吸出大塊肝臟組織，用移液槍溫和吹打用機械切割力幫助肝臟組織消化，當向加入與胰酶同體積的培養基時停止消化過程，得到肝臟組織消化液；c．細胞懸液的制備：將在所述步驟b中制備的肝臟組織消化液經孔徑為100μm細胞篩網過濾，得到細胞懸液，然后以1000rpm離心5min后，再移去上清，接著加入培養液輕輕吹打，使肝臟細胞重懸，然后用移液槍將細胞懸液緩慢溫和地加到Percoll分離液上方，使Percoll分離液和細胞懸液的體積比為7:3，采用Percoll分離液的濃度為70wt%，然后在4℃條件下，以1000rpm再次離心10min，再取底層的肝臟細胞沉淀，然后將分離出來肝臟細胞中加入細胞培養液，并輕輕吹打，使肝臟細胞重懸，再次得到細胞懸液；當再次離心細胞懸液后，細胞懸液優選形成四層，在上而下分別為培養基層、死細胞、碎片和雜細胞混合層、分離液層和肝實質層，細胞沉淀取自肝實質層；d．鯉魚肝臟細胞培養：用細胞培養基液稀釋在所述步驟c中最后制備的細胞懸液，使細胞懸液稀釋到1×106cells/ml的濃度水平，然后采用鋪板法培養鯉魚肝細胞，采用具有96孔板且每孔為200μl板進行鋪板，使鯉魚肝細胞在26℃條件下進行培養增殖，最終得到離體鯉魚原代肝細胞；在所述步驟a和b中，D-Hank’s平衡鹽工作液組成為：由99ml的無Ca2+Mg2+的HBSS和1ml的濃度為1wt%雙抗儲液混合制備而成；在所述步驟c中，Percoll分離液的配制：采用Percoll原液90mL與無Ca2+Mg2+HBSS的10mL進行混合，制成滲透壓為335mOsm的Percoll工作液，然后取35mL的Percoll工作液與15mL無Ca2+Mg2+HBSS進行混合，并在1000rpm條件下離心3min，即獲得濃度為70wt%的Percoll梯度分離液，并控制Percoll梯度分離液的密度為1.06～1.07g/mL，即得到所需的Percoll分離液，備用；在所述步驟d中，進行鋪板法時所用的培養基液組成為：按照70ml的L-15培養基、20ml的DMEM培養基、10ml的鯉魚血清、1ml的濃度為0.01M的Hepes緩沖液、1ml的濃度為1wt%的雙抗儲液的混合組分配比進行混合，然后在按照上述組分比例配制培養基液后，再用濃度為1M的NaOH儲液調節培養基液的pH至7.0-7.4之間，然后用0.22μm濾頭過濾分裝培養基液，得到培養基液，為鋪板法備用；在制備培養基液時，其中鯉魚血清的制備方法如下：用魚用麻醉劑將魚麻醉5分鐘后，用無菌注射器從尾靜采集鯉魚血液，并將其置于不含抗凝劑的試管內，在室溫下自然凝集30-40min，密封試管，以2000-3000rpm的速度離心10min，用移液槍將血清移出，然后在-20℃下進行保存，備用進行培養基液的制備。作為本專利技術優選的技術方案，選擇規格均勻、體格健壯的鯉魚時滿足如下飼養條件：水溫25±1℃，光照周期為光照:黑暗=14h:10h，并且保持每天喂食兩次。本專利技術與現有技術相比較，具有如下顯而易見的突出實質性特點和顯著優點：1.本專利技術方法提取鯉魚原代肝細胞所需時間短，細胞數量多，純度和成活率高，細胞存活率高，操作簡單可行；2.本專利技術方法直接無菌取鯉魚肝臟，經Percolll純化肝細胞，經鑒定，確實得到了數量多、純度高的離體鯉魚本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種鯉魚原代肝細胞的提取和培養方法，其特征在于，選擇規格均勻、體格健壯的平均體重400?600?g的鯉魚預養2周，然后，在無菌條件下進行如下過程：a．無菌取鯉魚肝臟和鯉魚肝臟預處理：用魚用麻醉劑將魚麻醉5分鐘后，用無菌注射器從尾靜脈抽血至魚腮微白，用剪刀從肛門處沿腹中線向前剪至下頜，再沿鰓蓋后緣剪至下頜，打開左側體壁肌肉，找到鯉魚肝臟所在位置，用高壓滅菌的解剖器具無菌取肝臟，并將之置于D?Hank’s平衡鹽工作液中，用D?Hank’s平衡鹽工作液清洗肝臟組織2?3次至肝臟發白，以洗去肝臟組織中殘留的血液，完成鯉魚肝臟預處理過程；b．機械破碎鯉魚肝臟和對鯉魚肝臟和消化處理：將在所述步驟a中選取和經過預處理的鯉魚肝臟剪碎成約1?mm?×?1?mm?塊狀，再用D?Hank’s平衡鹽工作液清洗肝臟組織塊至少1次，然后加入塊狀鯉魚肝臟的10倍體積的0.25%胰酶，在在25℃條件下進行40?min消化處理，在消化期間不斷轉動肝臟組織，消化處理后吸出大塊肝臟組織，用移液槍溫和吹打用機械切割力幫助肝臟組織消化，當向加入與胰酶同體積的培養基時停止消化過程，得到肝臟組織消化液；c．細胞懸液的制備：將在所述步驟b中制備的肝臟組織消化液經孔徑為100?μm細胞篩網過濾，得到細胞懸液，然后以1000?rpm離心5?min后，再移去上清，接著加入培養液輕輕吹打，使肝臟細胞重懸，然后用移液槍將細胞懸液緩慢溫和地加到Percoll分離液上方，使Percoll分離液和細胞懸液的體積比為7:3，采用Percoll分離液的濃度為70wt%，然后在4℃條件下，以1000?rpm再次離心10?min，再取底層的肝臟細胞沉淀，然后將分離出來肝臟細胞中加入細胞培養液，并輕輕吹打，使肝臟細胞重懸，再次得到細胞懸液；d．鯉魚肝臟細胞培養：用細胞培養基液稀釋在所述步驟c中最后制備的細胞懸液，使細胞懸液稀釋到1×106?cells/ml的濃度水平，然后采用鋪板法培養鯉魚肝細胞，采用具有96孔板且每孔為200?μl板進行鋪板，使鯉魚肝細胞在26℃條件下進行培養增殖，最終得到離體鯉魚原代肝細胞；在所述步驟a和b中，D?Hank’s平衡鹽工作液組成為：由99?ml的無Ca2+Mg2+的HBSS和1?ml的濃度為1wt%雙抗儲液混合制備而成；在所述步驟c中，Percoll分離液的配制：采用Percoll原液90?mL與無Ca2+?Mg2+HBSS的10?mL進行混合，制成滲透壓為335?mOsm的Percoll工作液，然后取35?mL的Percoll工作液與15?mL無Ca2+?Mg2+HBSS進行混合，并在1000?rpm條件下離心3?min，即獲得濃度為70wt%的Percoll梯度分離液，并控制Percoll梯度分離液的密度為1.06～1.07?g/mL，即得到所需的Percoll分離液，備用；在所述步驟d中，進行鋪板法時所用的培養基液組成為：按照70?ml的L?15培養基、20?ml的DMEM培養基、10?ml的鯉魚血清、1?ml的濃度為0.01?M的Hepes緩沖液、1?ml的濃度為1wt%的雙抗儲液的混合組分配比進行混合，然后在按照上述組分比例配制培養基液后，再用濃度為1?M的?NaOH儲液調節培養基液的pH至7.0?7.4之間，然后用0.22?μm濾頭過濾分裝培養基液，得到培養基液，為鋪板法備用；在制備培養基液時，其中鯉魚血清的制備方法如下：用魚用麻醉劑將魚麻醉5分鐘后，用無菌注射器從尾靜采集鯉魚血液，并將其置于不含抗凝劑的試管內，在室溫下自然凝集30?40?min，密封試管，以2000?3000?rpm的速度離心10min，用移液槍將血清移出，然后在?20℃下進行保存，備用進行培養基液的制備。...
【技術特征摘要】
1.一種鯉魚原代肝細胞的提取和培養方法，其特征在于，選擇規格均勻、體格健壯的平
均體重400-600g的鯉魚預養2周，然后，在無菌條件下進行如下過程：
a．無菌取鯉魚肝臟和鯉魚肝臟預處理：用魚用麻醉劑將魚麻醉5分鐘后，用無菌注射器
從尾靜脈抽血至魚腮微白，用剪刀從肛門處沿腹中線向前剪至下頜，再沿鰓蓋后緣剪至下
頜，打開左側體壁肌肉，找到鯉魚肝臟所在位置，用高壓滅菌的解剖器具無菌取肝臟，并將
之置于D-Hank’s平衡鹽工作液中，用D-Hank’s平衡鹽工作液清洗肝臟組織2-3次至肝臟發
白，以洗去肝臟組織中殘留的血液，完成鯉魚肝臟預處理過程；
b．機械破碎鯉魚肝臟和對鯉魚肝臟和消化處理：將在所述步驟a中選取和經過預處理
的鯉魚肝臟剪碎成約1mm×1mm塊狀，再用D-Hank’s平衡鹽工作液清洗肝臟組織塊至
少1次，然后加入塊狀鯉魚肝臟的10倍體積的0.25%胰酶，在在25℃條件下進行40min消化
處理，在消化期間不斷轉動肝臟組織，消化處理后吸出大塊肝臟組織，用移液槍溫和吹打用
機械切割力幫助肝臟組織消化，當向加入與胰酶同體積的培養基時停止消化過程，得到肝
臟組織消化液；
c．細胞懸液的制備：將在所述步驟b中制備的肝臟組織消化液經孔徑為100μm細胞篩
網過濾，得到細胞懸液，然后以1000rpm離心5min后，再移去上清，接著加入培養液輕輕吹
打，使肝臟細胞重懸，然后用移液槍將細胞懸液緩慢溫和地加到Percoll分離液上方，使
Percoll分離液和細胞懸液的體積比為7:3，采用Percoll分離液的濃度為70wt%，然后在4℃
條件下，以1000rpm再次離心10min，再取底層的肝臟細胞沉淀，然后將分離出來肝臟細胞
中加入細胞培養液，并輕輕吹打，使肝臟細胞重懸，再次得到細胞懸液；
d．鯉魚肝臟細胞培養：用細胞培養基液稀釋在所述步驟c中最后制備的細胞懸液，使細
胞懸液稀釋到1×106cells/ml的濃度水平，然后采用鋪板法培養鯉魚肝細胞，采用具有96
孔板且每孔為200μl板進行鋪板，使鯉魚肝細胞在26℃條件下進行培養增殖，最終得到離<...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊明，李意捷，雷鵬輝，蔣麗輝，吳明紅，
申請(專利權)人：上海大學，
類型：發明
國別省市：上海;31
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