一種檢測弓形蟲抗體的膠體金試紙條制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了檢測弓形蟲抗體的膠體金試紙條。本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種檢測弓形蟲的膠體金試紙條。本發(fā)明專利技術(shù)提供的膠體金試紙條，包括底板和放置在其上的樣品墊、包被有金標蛋白的金標墊、含有檢測線T和質(zhì)控線C的硝酸纖維素膜和吸水墊；本發(fā)明專利技術(shù)的實驗證明，本發(fā)明專利技術(shù)制備一種膠體金試紙條，可同時檢測出動物體內(nèi)弓形蟲的血清抗體，便于對動物的原蟲感染進行鑒別診斷，節(jié)約成本，操作簡便，適用于檢測豬、犬、貓等動物。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬血清學檢測領(lǐng)域，涉及一種檢測弓形蟲抗體的膠體金試紙條。
技術(shù)介紹
弓形蟲病(Toxoplasmosis)是由專性胞內(nèi)寄生原蟲龔地弓形蟲(Toxoplasmagondii，簡稱弓形蟲)引起的，是一種全世界范圍內(nèi)流行的人畜共患疾病。弓形蟲可以感染多種動物和人，其感染的發(fā)生、癥狀以及致病性與弓形蟲基因型、感染量和宿主的遺傳背景及免疫狀態(tài)密切相關(guān)。大多數(shù)宿主感染弓形蟲通常表現(xiàn)出相對較輕的癥狀，但若機體免疫力低下，則導(dǎo)致嚴重疾病甚至引起死亡。弓形蟲病的另一危害是引起妊娠動物流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙。對弓形蟲的感染和發(fā)病的診斷方法包括病原學、血清學、分子生物學和免疫病理學等。病原學診斷包括組織涂片檢查、動物接種等。分子生物學診斷方法如PCR。免疫學(包括血清學)診斷方法主要有補體結(jié)合試驗(CFT)、凝集試驗(AT)、間接熒光抗體試驗(IFAT)、間接血凝試驗(IHA)、免疫膠體金技術(shù)(ICT)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等。膠體金免疫層析技術(shù)是一種新型的免疫學快速診斷技術(shù)，具有敏感、特異、便捷等特點，便于現(xiàn)場檢測，在多種病原的感染和殘留檢測等方面都得到了廣泛應(yīng)用。已有用弓形蟲SAG2的重組蛋白研制出膠體金免疫層析試紙條(TgGICA)，以LAT和ELISA方法分別作為參照，結(jié)果顯示TgGICA的敏感性和特異性為100％、97.2％和94.5％、95.8％，與兩種參照方法的符合率分別為95.5％和96.1％(Huang等)。綜上所述，專利技術(shù)一種操作簡便、受環(huán)境因素影響小、需要樣品量少、特異性與敏感性強的膠體金試紙條對檢測多種動物的弓形蟲感染具有重要的意義。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的一個目的是提供一種檢測弓形蟲的膠體金試紙條。本專利技術(shù)提供的膠體金試紙條，包括底板和放置在其上的樣品墊、包被有金標蛋白的金標墊、含有檢測線T和質(zhì)控線C的檢測墊和吸水墊；所述檢測線T由TgGRA1蛋白溶液形成；所述TgGRA1蛋白為如下a或b或c：a)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；b)在序列2所示的蛋白質(zhì)的N端和C端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)；c)將a)或b)所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白質(zhì)。上述膠體金試紙條中，所述檢測墊可由硝酸纖維素膜制成。上述膠體金試紙條中，所述TgGRA1蛋白溶液中TgGRA1蛋白的濃度為2mg/ml。上述膠體金試紙條中，所述金標蛋白為膠體金標記的SPA蛋白。上述膠體金試紙條中，所述質(zhì)控線C由IgG蛋白或IgG蛋白溶液形成；所述IgG蛋白具體為豬IgG蛋白；所述豬IgG蛋白溶液的濃度尤其具體為1mg/ml。本專利技術(shù)另一個目的是提供一種制備上述的膠體金試紙條的方法。本專利技術(shù)提供的方法，包括如下步驟：1)制備包被有金標蛋白的金標墊和含有檢測線T和質(zhì)控線C的硝酸纖維素膜；所述包被有金標蛋白的金標墊按照如下方法制備：將膠體金溶液和SPA蛋白混勻，反應(yīng)，得到金標蛋白；再將所述金標蛋白加到玻璃纖維素膜上，得到包被有金標蛋白的金標墊；所述含有檢測線T和質(zhì)控線C的硝酸纖維素膜為將權(quán)利要求1-4中任一中的所述TgGRA1蛋白溶液和所述IgG蛋白溶液分別包被在硝酸纖維素膜上，形成含有檢測線T和質(zhì)控線C的硝酸纖維素膜；2)將所述包被有金標蛋白的金標墊、樣品墊、所述含有檢測線T和質(zhì)控線C的硝酸纖維素膜和吸水墊組裝到底板上，得到所述膠體金試紙條。上述方法中，所述膠體金溶液和所述SPA蛋白的加入配比為1ml:7μg；所述膠體金溶液中的膠體金粒徑為20nm。上述TgGRA1蛋白或所述TgGRA1蛋白溶液或上述的膠體金試紙條在制備檢測或輔助檢測弓形蟲產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本專利技術(shù)保護的范圍。上述TgGRA1蛋白或所述TgGRA1蛋白溶液或上述的膠體金試紙條在制備檢測或輔助檢測待測樣本或待測動物或待測人是否感染弓形蟲產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本專利技術(shù)保護的范圍。上述應(yīng)用中，所述產(chǎn)品為試劑盒。所述動物為哺乳動物，所述哺乳動物具體為豬、犬或貓。本專利技術(shù)的實驗證明，本專利技術(shù)制備一種膠體金試紙條，可同時檢測出動物體內(nèi)弓形蟲的血清抗體，便于對動物的原蟲感染進行鑒別診斷，節(jié)約成本，操作簡便，適用于檢測豬、犬、貓等動物。本專利技術(shù)操作簡便、受環(huán)境因素影響小、需要樣品量少。是一種能夠同時檢測多種動物弓形蟲血清抗體的、特異性與敏感性強的膠體金試紙條。附圖說明圖1為TgGRA1的純化蛋白。圖2為試紙條組裝示意圖。圖3為試紙條檢測的判定標準。圖4為試紙條交叉反應(yīng)的檢測。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。E.coliTransetta(DE3)菌株、2×TransTaqHighFidelity(HiFi)PCRSuperMix等：購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。SPA：葡萄球菌A蛋白，10mg裝，購自ProSpec公司。樣品墊(血清專用墊)、玻璃纖維素膜、硝酸纖維素膜、吸水墊等，購自上海杰一生物技術(shù)有限公司。下面結(jié)合具體實施例，對本專利技術(shù)進行詳細說明。實施例1、TgGRA1蛋白制備1、TgGRA1基因的克隆設(shè)計引物擴增TgGRA1基因，引物如下表1所示。引物兩端含酶切位點，用小寫表示，引物5＇端增加保護堿基，3＇端為TgGRA1基因序列。表1為用于擴增TgGRA1基因的引物以弓形蟲RH株的cDNA為模板，用TgGRA1基因的上游引物和下游引物進行PCR擴增，得到495bpPCR產(chǎn)物，為TgGRA1基因，經(jīng)過測序，TgGRA1基因的核苷酸序列為序列表中序列1，TgGRA1基因編碼的蛋白TgGRA1，蛋白TgGRA1的氨基酸序列為序列表中序列2；上述反應(yīng)體系如下表2：表2為反應(yīng)體系PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10min，進行31輪循環(huán)，循環(huán)包括94℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min。最后72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察電泳條帶。利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收與目的片段大小相符條帶，-20℃保存。2、TgGRA1蛋白的制備1)、pET-28a-TgGRA1質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒pET-28a-TgGRA1為將序列表中序列1所示的TgGRA1基因插入pET-28a載體的BamHI和XholI酶切位點間得到的載體，與pET-28a載體上的his標簽融合表達帶有標簽T本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種檢測弓形蟲的膠體金試紙條，包括底板和放置在其上的樣品墊、包被有金標蛋白的金標墊、含有檢測線T和質(zhì)控線C的檢測墊和吸水墊；所述檢測線T由TgGRA1蛋白溶液形成；所述TgGRA1蛋白為如下a或b或c：a)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；b)在序列2所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)；c)將a)或b)所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白質(zhì)。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測弓形蟲的膠體金試紙條，包括底板和放置在其上的樣品墊、包被有金標蛋
白的金標墊、含有檢測線T和質(zhì)控線C的檢測墊和吸水墊；
所述檢測線T由TgGRA1蛋白溶液形成；
所述TgGRA1蛋白為如下a或b或c：
a)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；
b)在序列2所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)；
c)將a)或b)所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添
加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金試紙條，其特征在于：
所述TgGRA1蛋白溶液中TgGRA1蛋白的濃度為2mg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的膠體金試紙條，其特征在于：
所述金標蛋白為膠體金標記的SPA蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的膠體金試紙條，其特征在于：
所述質(zhì)控線C由IgG蛋白或IgG蛋白溶液形成；
所述IgG蛋白具體為豬IgG蛋白；
所述豬IgG蛋白溶液的濃度尤其具體為1mg/ml。
5.一種制備權(quán)利要求1-4中任一所述的膠體金試紙條的方法，包括如下步驟：
1)制備包被有金標蛋白的金標墊和含有檢測線T和質(zhì)控線C的硝酸纖維素膜；
所述包被有金標蛋...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉群，南匯珠，劉晶，
申請(專利權(quán))人：中國農(nóng)業(yè)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：北京;11