一種基因工程藍藻及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種基因工程藍藻，本發明專利技術提供的基因工程藍藻可以通過光合作用直接利用CO2高效生產苯丙烷類物質，避免了碳水和化合物的消耗和昂貴前體的使用，并且可以提高許多苯丙烷代謝的重要節點化合物的產量。本發明專利技術還提供了該基因工程藍藻的應用，尤其是在生產苯丙烷類物質中的應用，為苯丙烷類物質的生產開辟了新的技術，降低了生產成本，具有重要的應用前景。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于基因工程領域，具體涉及一種基因工程藍藻，本專利技術提供的基因工程藍藻可以通過光合作用直接利用CO2高效生產苯丙烷類物質。
技術介紹
植物次生代謝是植物在長期進化中對生態環境適應的結果，其代謝產物具有多種復雜的生物學功能，在提高植物對環境的適應性、種間競爭能力和增強抗病性等方面起著重要作用，植物次生代謝物也為醫藥、化工、食品、顏料及農藥等產業提供了寶貴的原料。作為天然活性物質，植物次生代謝物為目前一些難以醫治的疾病提供了一條重要解決途徑。苯丙烷類物質是一類重要的植物次生代謝產物，主要包括黃酮類、芪類和簡單酚類等，在植物中，大多數苯丙烷類物質都是由酪氨酸或苯丙氨酸經脫氨基后形成對香豆酸進而產生。苯丙烷類物質具有較強生理活性及藥理作用，如異黃酮能預防骨質疏松、更年期綜合癥，及以乳腺癌為代表的多種癌癥；白藜蘆醇能夠預防心血管疾病、動脈硬化等疾病。此外，苯丙烷類物質及其衍生物還廣泛的用作化工原料、食品添加劑和香料等，如香蘭素是目前世界應用最為廣泛的天然香料之一。盡管苯丙烷類等植物次生代謝產物對人類產生了巨大的作用，但這些天然產物在植物中的含量低，分離和提取較為復雜，并且許多物質在特定植物的特定部位才能產生，使得它們的產量極低，不能滿足人們對于植物次生代謝產物日益增長的需求量。化學合成法雖然能合成一些結構相對簡單的苯丙烷類物質，但環境問題的日益凸顯和人們對于食品安全的重視，限制了這種方法的發展。由于工藝簡單、分離和提取簡便、安全無污染等優勢，利用微生物發酵來合成植物次生代謝產物成為研究的熱點。如，2005年，Yan等人利用基因工程酵母菌將對香豆酸轉化為28.3mg/L柚皮素(Yan,Y.,Kohli,A.,Koffas,M.A.BiosynthesisofnaturalflavanonesinSaccharomycescerevisiae.Appl.Environ.Microbiol.,2005,71:5610-5613.)；2012年，Lin等人利用酪氨酸高產的重組大腸桿菌將葡萄糖轉化為50.2mg/L咖啡酸(Lin,Y.,Yan,Y.BiosynthesisofcaffeicacidinEscherichiacoliusingitsendogenoushydroxylasecomplex.Microb.CellFact.2012,11:42-50.)；Kang等人在大腸桿菌中導入苯丙烷類物質合成的相關基因，可以將葡萄糖轉化為974mg/L對香豆酸、150mg/L咖啡酸和196mg/L阿魏酸(Kang,S.Y.,Choi,O.,Lee,J.K.,Hwang,B.Y.,Uhm,T.B.,Hong,Y.S.ArtificialbiosynthesisofphenylpropanoicacidsinatyrosineoverproducingEscherichiacolistrain.Microb.CellFact.2012,11,153.)。雖然這些生產技術可以得到一定量的苯丙烷類物質，但一般微生物缺乏充足的ATP和NADPH提供給這些外源合成途徑，使得產量陷入瓶頸。而且生產過程需要添加碳水化合物或者昂貴的前體物質，使得這種生產方式并不十分經濟。此外，許多苯丙烷類合成途徑需要一些普通工業微生物難以表達的植物酶類，限制了這種生物生產技術的應用。藍藻是可以進行光合作用的原核生物，廣泛分布在淡水、海水甚至污水。藍藻生長迅速，結構和遺傳背景簡單，易于基因操作，最為突出的是它能將太陽能和溫室氣體CO2直接轉化為產物，是實現可持續生產的最佳途徑之一。此外，由于可以光合作用，使得藍藻具有充足的ATP和NADPH；作為植物的祖先，藍藻也可以表達絕大多數植物來源的酶，這些特點使得藍藻尤為適合作為苯丙烷類合成的載體。然而，目前并未有對藍藻進行基因改造，使其直接利用CO2和太陽能來合成苯丙烷類物質的相關報道。
技術實現思路
有鑒于現有技術的上述缺陷，本專利技術提供了一種基因工程藍藻，本專利技術提供的基因工程藍藻可直接轉化CO2來生產苯丙烷類物質。為解決上述問題，本專利技術采取的技術方案是：一種基因工程藍藻，所述基因工程藍藻由以下方法的其中之一制備而成：方法一：將解反饋抑制的3-脫氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的編碼基因和酪氨酸解氨酶的編碼基因導入野生藍藻的基因組DNA得到產對香豆酸的基因工程藍藻；方法二：將解反饋抑制的3-脫氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的編碼基因、酪氨酸解氨酶的編碼基因和對香豆酸羥化酶的編碼基因導入野生藍藻的基因組DNA得到產咖啡酸的基因工程藍藻；方法三：將解反饋抑制的3-脫氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的編碼基因、酪氨酸解氨酶的編碼基因、對香豆酸羥化酶的編碼基因和咖啡酸甲基轉移酶的編碼基因導入野生藍藻的基因組DNA得到產阿魏酸的基因工程藍藻；方法四：將解反饋抑制的3-脫氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的編碼基因、酪氨酸解氨酶的編碼基因、對香豆酰輔酶A連接酶的編碼基因和芪合酶的編碼基因導入野生藍藻的基因組DNA得到產白藜蘆醇的基因工程藍藻；方法五：將解反饋抑制的3-脫氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的編碼基因、酪氨酸解氨酶的編碼基因、對香豆酰輔酶A連接酶的編碼基因、查耳酮合酶的編碼基因和查爾酮異構酶的編碼基因導入野生藍藻的基因組DNA得到產柚皮素的基因工程藍藻；方法六：將解反饋抑制的3-脫氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的編碼基因、酪氨酸解氨酶的編碼基因、對香豆酰輔酶A連接酶的編碼基因和姜黃素合酶的編碼基因導入野生藍藻的基因組DNA得到的產雙去甲氧基姜黃素的基因工程藍藻。優選地，所述野生藍藻選自聚球藻屬、集胞藻屬、隱球藻屬、魚腥藻屬、念珠藻屬、顫藻屬、球藻屬、阿格藻屬、雙歧藻屬和鞭枝藻屬等藍藻。更優選地，所述野生藍藻為集胞藻(Synechocystissp.)。優選地，外源基因通過串聯在質粒中導入野生藍藻的基因組DNA。更優選地，串聯表達的外源基因結構含有一個與串聯結構中第一個基因可操作地連接的啟動子，或是所述串聯結構上每個基因各自獨立帶有可操作地連接的啟動子。更優選地，所述啟動子為trc啟動子。優選地，所述的解反饋抑制的3-脫氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的編碼基因如SEQIDNO:1所示或者能與SEQIDNO:1所示的核酸序列的互補鏈雜交；所述的酪氨酸解氨酶的編碼基因如SEQIDNO:2所示或者能與SEQIDNO:2所示的核酸序列的互補本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基因工程藍藻，其特征在于，所述基因工程藍藻由以下方法的其中之一制備而成：方法一：將解反饋抑制的3?脫氧?2?阿拉伯庚酮糖?7?磷酸合成酶的編碼基因和酪氨酸解氨酶的編碼基因導入野生藍藻的基因組DNA得到產對香豆酸的基因工程藍藻；方法二：將解反饋抑制的3?脫氧?2?阿拉伯庚酮糖?7?磷酸合成酶的編碼基因、酪氨酸解氨酶的編碼基因和對香豆酸羥化酶的編碼基因導入野生藍藻的基因組DNA得到產咖啡酸的基因工程藍藻；方法三：將解反饋抑制的3?脫氧?2?阿拉伯庚酮糖?7?磷酸合成酶的編碼基因、酪氨酸解氨酶的編碼基因、對香豆酸羥化酶的編碼基因和咖啡酸甲基轉移酶的編碼基因導入野生藍藻的基因組DNA得到產阿魏酸的基因工程藍藻；方法四：將解反饋抑制的3?脫氧?2?阿拉伯庚酮糖?7?磷酸合成酶的編碼基因、酪氨酸解氨酶的編碼基因、對香豆酰輔酶A連接酶的編碼基因和芪合酶的編碼基因導入野生藍藻的基因組DNA得到產白藜蘆醇的基因工程藍藻；方法五：將解反饋抑制的3?脫氧?2?阿拉伯庚酮糖?7?磷酸合成酶的編碼基因、酪氨酸解氨酶的編碼基因、對香豆酰輔酶A連接酶的編碼基因、查耳酮合酶的編碼基因和查爾酮異構酶的編碼基因導入野生藍藻的基因組DNA得到產柚皮素的基因工程藍藻；方法六：將解反饋抑制的3?脫氧?2?阿拉伯庚酮糖?7?磷酸合成酶的編碼基因、酪氨酸解氨酶的編碼基因、對香豆酰輔酶A連接酶的編碼基因和姜黃素合酶的編碼基因導入野生藍藻的基因組DNA得到的產雙去甲氧基姜黃素的基因工程藍藻。...

【技術特征摘要】
1.一種基因工程藍藻，其特征在于，所述基因工程藍藻由以下方法的其中之一
制備而成：
方法一：將解反饋抑制的3-脫氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的編碼基因
和酪氨酸解氨酶的編碼基因導入野生藍藻的基因組DNA得到產對香豆酸的基
因工程藍藻；
方法二：將解反饋抑制的3-脫氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的編碼基因、
酪氨酸解氨酶的編碼基因和對香豆酸羥化酶的編碼基因導入野生藍藻的基因
組DNA得到產咖啡酸的基因工程藍藻；
方法三：將解反饋抑制的3-脫氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的編碼基因、
酪氨酸解氨酶的編碼基因、對香豆酸羥化酶的編碼基因和咖啡酸甲基轉移酶的
編碼基因導入野生藍藻的基因組DNA得到產阿魏酸的基因工程藍藻；
方法四：將解反饋抑制的3-脫氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的編碼基因、
酪氨酸解氨酶的編碼基因、對香豆酰輔酶A連接酶的編碼基因和芪合酶的編碼
基因導入野生藍藻的基因組DNA得到產白藜蘆醇的基因工程藍藻；
方法五：將解反饋抑制的3-脫氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的編碼基因、
酪氨酸解氨酶的編碼基因、對香豆酰輔酶A連接酶的編碼基因、查耳酮合酶的
編碼基因和查爾酮異構酶的編碼基因導入野生藍藻的基因組DNA得到產柚皮
素的基因工程藍藻；
方法六：將解反饋抑制的3-脫氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的編碼基因、
酪氨酸解氨酶的編碼基因、對香豆酰輔酶A連接酶的編碼基因和姜黃素合酶的
編碼基因導入野生藍藻的基因組DNA得到的產雙去甲氧基姜黃素的基因工程
藍藻。
2.如權利要求1所述的基因工程藍藻，其特征在于，所述野生藍藻選自聚球藻
屬、集胞藻屬、隱球藻屬、魚腥藻屬、念珠藻屬、顫藻屬、球藻屬、阿格藻屬、
雙歧藻屬和鞭枝藻屬等藍藻。
3.如權利要求2所述的基因工程藍藻，其特征在于，所述野生藍藻為集胞藻
(Synechocystissp.)。
4.如權利要求1所述的基因工程藍藻，其特征在于，外源基因通過串聯在質粒
中導入野生藍藻的基因組DNA。
5.如權利要求4所述的基因工程藍藻，其特征在于，串聯表達的外源基因結構
含...

【專利技術屬性】
技術研發人員：許平，倪俊，陶飛，唐鴻志，
申請(專利權)人：上海交通大學，
類型：發明
國別省市：上海;31