本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及了一種豬MRC1基因5′調(diào)控區(qū)突變位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法及其在豬抗豬圓環(huán)病毒病育種中的應(yīng)用，發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)人發(fā)現(xiàn)在不同品種豬中MRC1?5′調(diào)控區(qū)存在多處差異，其中－864位點(diǎn)處存在14bp堿基的插入\缺失，通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，有14bp堿基插入的啟動(dòng)子熒光素酶活性顯著高于14bp堿基缺失的啟動(dòng)子熒光素酶活性，與抗豬圓環(huán)病毒病性較強(qiáng)的萊蕪豬群體含14bp堿基插入這一等位基因的頻率高于西方豬種，且MRC1基因的mRNA表達(dá)水平高相一致。可見(jiàn)通過(guò)檢測(cè)豬基因組中MRC1基因調(diào)控區(qū)－864位點(diǎn)的基因型作為與豬抗豬圓環(huán)病毒病性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，不僅方法簡(jiǎn)便快速，而且不受環(huán)境影響，并可實(shí)現(xiàn)早期選種。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種篩選抗豬圓環(huán)病毒病豬的MRC1分子標(biāo)記育種方法及其應(yīng)用
本專(zhuān)利技術(shù)涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及了一種篩選抗豬圓環(huán)病毒病豬的育種方法，通過(guò)判斷豬MRC1基因5′調(diào)控區(qū)突變位點(diǎn)的多態(tài)性來(lái)進(jìn)行選種，并人為的應(yīng)用該突變位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)優(yōu)良育種。
技術(shù)介紹
自1982年Tischer等在PK15細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirus,PCV)以來(lái)，對(duì)其的研究已有約34年的歷史。PCV分為無(wú)致病性的PCV1和強(qiáng)致病性的PCV2兩種亞型。PCV2主要感染5～15周齡的豬，致死率約為15％。它是引起斷奶后仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PWMS)、呼吸道疾病綜合征(PRDS)、豬皮炎腎炎綜合征(PDNS)的主要病原(Stevensonetal.,2001)。PCV2感染機(jī)體后能引起免疫抑制，在與其它病原體一同共感染或繼發(fā)感染時(shí)，將會(huì)加重病情，嚴(yán)重的則會(huì)造成機(jī)體死亡。豬的抗病性狀屬于中等遺傳力水平的閾性狀，對(duì)病毒引起的疾病所產(chǎn)生的抗性是可以遺傳的。Opriessnig等的研究發(fā)現(xiàn)在感染PCV2后，皮特蘭豬所表現(xiàn)出的臨床癥狀最為嚴(yán)重，長(zhǎng)白豬次之，杜洛克豬和大白豬的癥狀表現(xiàn)相對(duì)較輕。同時(shí)，本研究團(tuán)隊(duì)前期的研究發(fā)現(xiàn)在感染PCV2后，大長(zhǎng)雜交豬出現(xiàn)日增重減慢、體溫升高、腹瀉、皮膚出現(xiàn)紫斑以及肺臟和脾臟出現(xiàn)充血、出血等癥狀，而萊蕪豬卻表現(xiàn)溫和，無(wú)明顯病變。以上結(jié)果表明不同品種豬對(duì)PCV2的抗性存在遺傳差異，地方品種豬抗PCV2的能力較強(qiáng)。豬不同品種間對(duì)PCV2的抗性存在遺傳差異，這為抗豬圓環(huán)病毒病豬的育種提供了基礎(chǔ)和前提。萊蕪豬具有抗病耐粗、多胎高產(chǎn)、哺育力強(qiáng)、肉質(zhì)好等優(yōu)良特性。調(diào)查顯示，自2000年以來(lái)，在西方豬種PCV2感染率及死亡率呈逐漸升高的趨勢(shì)，而我國(guó)地方品種萊蕪豬未出現(xiàn)PCV2感染的報(bào)道，表現(xiàn)出對(duì)PCV2強(qiáng)的抗感染能力。本研究團(tuán)隊(duì)利用數(shù)字表達(dá)譜測(cè)序?qū)Ρ攘丝共⌒詮?qiáng)的萊蕪豬和易感的大長(zhǎng)雜交豬感染PCV2后肺臟組織表達(dá)譜的差異，篩選出大量的差異表達(dá)基因，并根據(jù)定量驗(yàn)證的結(jié)果發(fā)現(xiàn)攻毒后的豬MRC1基因的mRNA表達(dá)在大長(zhǎng)雜交豬的肺臟中顯著下降；而在萊蕪豬中的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，且出現(xiàn)上升趨勢(shì)(圖1)。這提示了MRC1基因可能與豬圓環(huán)病毒病的抗性有關(guān)。甘露糖受體家族基因(Mannosereceptorgene，MRC1)基因編碼的甘露糖受體屬于C型凝集素超家族中的一員，是一種保守的模式識(shí)別受體(PatternRecognitionReceptor，PRR)(Eastetal.,2002)。自20世紀(jì)70年代MR的首次發(fā)現(xiàn)至今，發(fā)現(xiàn)其主要表達(dá)于單核-吞噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、氣管平滑肌細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞、肝竇狀隙細(xì)胞等的表面(孟巧紅，2008)。MR主要通過(guò)識(shí)別和結(jié)合細(xì)胞表面或病原體細(xì)胞壁上的多糖分子，參與受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，并通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)和遞呈抗原，啟動(dòng)免疫應(yīng)答、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，來(lái)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定(Sehweizeretal.,2000)。同時(shí)MR將固有免疫與獲得性免疫聯(lián)系起來(lái)，組成機(jī)體的一種免疫防御機(jī)制(徐明，2002)。MRC1的表達(dá)受到細(xì)胞因子等其它因素的復(fù)雜調(diào)節(jié)。例如：IL-4、IL-13、IL-10、前列腺素E(PGE)、地塞米松、1,25-一二經(jīng)維生素D3等能夠上調(diào)MRC1的表達(dá)；而IFN-α、IFN-γ、LPS能夠下調(diào)MRC1的表達(dá)(Cardona-Mayaetal.,2006)。研究發(fā)現(xiàn)DC細(xì)胞表面的MR能夠誘導(dǎo)抗炎因子IL-10，IL-1R拮抗劑的產(chǎn)生，而不會(huì)誘導(dǎo)IL-1β，IL-12的產(chǎn)生，進(jìn)而有助于消除炎癥(Desleeetal.,2002)。同時(shí)，高表達(dá)于肺泡巨噬細(xì)胞表面的MR通過(guò)清除外來(lái)的顆粒，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，以此調(diào)節(jié)過(guò)強(qiáng)的炎性反應(yīng)維持肺組織的健康(Torrellesetal.,2010)。越來(lái)越多的研究表明，MR參與很多疾病的發(fā)生發(fā)展，如：肺炎鏈球菌的感染、急性肺損傷、慢性阻塞性肺炎等(李園園，2013)。通過(guò)對(duì)比萊蕪豬和大長(zhǎng)雜交豬MRC1基因的5′調(diào)控區(qū)系列，找到多處核苷酸序列的不同。對(duì)－864位點(diǎn)存在的14bp堿基插入\缺失的多態(tài)進(jìn)行了進(jìn)一步研究。我們的研究表明MRC1基因－864位點(diǎn)的14bp堿基缺失后，熒光素酶報(bào)告基因活性顯著降低，提示該位點(diǎn)的14bp堿基插入可能有增強(qiáng)MRC1基因轉(zhuǎn)錄的功能。由于MRC1的穩(wěn)定表達(dá)和豬抗圓環(huán)病毒病相一致，因此通過(guò)檢測(cè)該分子標(biāo)記，選擇MRC1高表達(dá)的豬只組建基礎(chǔ)群進(jìn)行育種，對(duì)于提高豬群體的抗圓環(huán)病毒病特性具有重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
基于上述的原因，本專(zhuān)利技術(shù)通過(guò)篩選出豬抗豬圓環(huán)病毒病相關(guān)的基因標(biāo)記，建立豬分子標(biāo)記輔助育種方法，為豬抗病品種培育提供基因標(biāo)記和技術(shù)方法。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，專(zhuān)利技術(shù)人通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)豬MRC15′調(diào)控區(qū)－864位點(diǎn)的14bp堿基插入\缺失突變?cè)隗w外試驗(yàn)中改變了MRC1啟動(dòng)子的活性，兩者差異顯著，可見(jiàn)檢測(cè)與突變相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記不僅方法簡(jiǎn)便快速，而且不受環(huán)境影響，并可實(shí)現(xiàn)早期選種。本專(zhuān)利技術(shù)提供的一種篩選抗豬圓環(huán)病毒病豬的MRC1分子標(biāo)記育種方法，該方法通過(guò)測(cè)定從該動(dòng)物獲得的DNA樣品中MRC1基因中多態(tài)性來(lái)實(shí)現(xiàn)的；通過(guò)多態(tài)性的測(cè)定結(jié)果，選出具有與所需特征相關(guān)的豬進(jìn)行育種；所述的多態(tài)性是與抗豬圓環(huán)病毒病相關(guān)的多態(tài)性。其具體方法如下：(1)豬基因組DNA的獲得；(2)分別以上述豬基因組DNA為模板，擴(kuò)增MRC1基因的5′調(diào)控區(qū)序列；(3)限制性?xún)?nèi)切酶酶切方法構(gòu)建不同載體，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染技術(shù)，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)不同載體的表達(dá)情況，找出調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵元件；(4)鑒定MRC1基因5′調(diào)控區(qū)多態(tài)性；(5)熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)定點(diǎn)突變位點(diǎn)對(duì)基因表達(dá)的影響；(6)群體檢測(cè)－864位點(diǎn)的多態(tài)性及標(biāo)記輔助育種。具體的標(biāo)記方法為：采用標(biāo)記引物MRC1M，包括MRC1MF：5′-GACGCGTCAAGAATGGCTCATTTAAATAT-3′其序列如SeqIDNo：3所示；MRC1MR：5′-CCCCGGGTGAAGAGAAGGGAGTTGG-3′其序列如SeqIDNo：4所示；我們的研究表明MRC1基因－864位點(diǎn)的14bp堿基缺失后，熒光素酶報(bào)告基因活性顯著降低，提示－864位點(diǎn)的14bp堿基插入可能有增強(qiáng)MRC1基因轉(zhuǎn)錄的功能。結(jié)合基因表達(dá)譜及熒光定量PCR結(jié)果可以看出MRC1基因的高表達(dá)與豬對(duì)豬圓環(huán)病毒病的抗性有關(guān)。通過(guò)分子標(biāo)記篩選含有14bp堿基插入等位基因的豬群進(jìn)行育種，可以獲得MRC1高表達(dá)的個(gè)體，對(duì)于提高豬群的抗豬圓環(huán)病毒病特性具有重要意義。綜上所述，本專(zhuān)利技術(shù)人通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)豬MRC15′調(diào)控區(qū)－864位點(diǎn)的14bp堿基插入\缺失突變?cè)隗w外試驗(yàn)中改變了MRC1啟動(dòng)子的活性，兩者差異顯著，可見(jiàn)檢測(cè)與突變相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記不僅方法簡(jiǎn)便快速，而且不受環(huán)境影響，并可實(shí)現(xiàn)早期選種。附圖說(shuō)明圖1為豬MRC1基因在肺臟的熒光定量PCR結(jié)果，其中LW-u為萊蕪豬對(duì)照組，LW-i為萊蕪豬攻毒組，YL-u為大長(zhǎng)雜交豬對(duì)照組，YL-i為大長(zhǎng)雜交豬攻毒組，*表示兩者差異顯著P<0.05；圖2為MRC1PF和MRC1PR引物PCR擴(kuò)增豬MRC1啟動(dòng)子－1956至+69片段電泳圖，其中M為DL5000Maker；圖3為構(gòu)建豬MRC1基因不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子片段的刪除載體，轉(zhuǎn)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種篩選抗豬圓環(huán)病毒病豬的輔助育種方法，其特征在于：該方法通過(guò)測(cè)定從該動(dòng)物獲得的DNA樣品中MRC1基因的多態(tài)性來(lái)實(shí)現(xiàn)的；通過(guò)多態(tài)性的測(cè)定結(jié)果，選出具有與所需特征相關(guān)的豬進(jìn)行育種；所述的多態(tài)性是指能使MRC1基因高表達(dá)并與抗豬圓環(huán)病毒病相關(guān)的多態(tài)性。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種篩選抗豬圓環(huán)病毒病豬的輔助育種的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：（1）豬基因組DNA的獲得；（2）以上述豬基因組DNA為模板，利用SeqIDNO:3和SeqIDNO:4所示的特異性引物擴(kuò)增MRC1基因5′調(diào)控區(qū)序列；（3）通過(guò)上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定MRC1基因5′調(diào)控區(qū)-8...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：姜運(yùn)良，劉浩，孫億，劉根，鹿宏宇，王巖超，張萍，王昱丁，馬才，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：山東;37
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