一種快速分離鑒定與保存甘薯白絹病菌的方法技術

本發明專利技術公開了一種快速分離鑒定與保存甘薯白絹病菌的方法，包括以下步驟：1)從甘薯白絹病的病樣中挑取菌絲或菌核接種于PDA培養基平板置于20～30℃進行培養；2)待PDA培養基平板長出新的菌絲后，挑取新的菌絲到新的PDA培養基平板上，進行純化培養；3)將所述純化的菌株在20～30℃條件下培養2～4d后，將菌絲塊作為接種體接種至健康甘薯莖枝，以PDA塊作為空白對照，在密封條件下，20～30℃培養1～3天，出現莖枝腐爛的現象確認為甘薯白絹病菌；4)接著對甘薯白絹病菌進行菌核培養，然后將菌核干燥并存放。本發明專利技術所述的方法，可實現甘薯白絹病菌的快速分離鑒定保存菌種過程簡單，工作量小，效率高，保藏菌種易管理，保存的菌種存活時間長，可達4年以上。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及微生物的分離鑒定和保存
，尤其涉及一種快速分離鑒定與保存甘薯白絹病菌的方法。
技術介紹
甘薯白絹病是由齊整小核菌(SclerotiumrolfsiiSacc.)引起的，從甘薯育苗期至收獲期均可能發生，發病田塊甘薯產量損失達20％以上，嚴重者甚至絕收。甘薯儲藏或銷售時，白絹病菌常導致薯蒂和薯尾腐爛，影響甘薯的品質和商品性。現階段甘薯白絹病的危害已成為甘薯產業的一個重要限制因素，對甘薯白絹病的發生規律，病原菌的生物學性狀、對殺菌劑的敏感性和對甘薯的致病性等進行研究，尋找理想的防控方法成為甘薯產業防治病害的重中之重。然而，開展病害所有研究的最基礎最根本工作是病原菌的分離鑒定與保存，可靠的病原菌分離鑒定和保存技術是病害防控技術研究的保證。目前甘薯白絹病菌通常的分離步驟包括：首先用水將病樣表面的泥沙沖洗干凈，在室內晾干后，選擇病樣病健交界部位作為分離材料，在超凈臺用接種刀切成小塊，經酒精或者升汞消毒后，用無菌水清洗2-3次后，用滅菌的鑷子將切塊放在PDA上置于25℃培養，待長出菌落后，對長出真菌進行純化，純化后還需要接種鑒定進行確認。作為常用的分離方法在病原菌的分離起到了極大的作用，然而通常存在，選取病健交界處材料具有一定不確定性，選擇不好則分離不到病原菌；此外不同的材料所需消毒時間不同，消毒時間太長容易將病原菌殺死或者消毒時間太短分離后出現大量的細菌或其他真菌，導致分離不到病原菌或需要大量的純化鑒定工作。因此，該分離方法需要有一定經驗、步驟較多、存在分離不到病原菌的風險。白絹病病原菌最常用的保存方法是將接種到PDA斜面上或者PDA培養基平板上白絹病菌放置在4℃冰箱進行低溫保存，該保存方法簡單有效，不需要特殊處理，但是一般只能保存2-3月，因此需要對白絹病菌不斷重新轉接培養保存。然而，多次轉接培養保存易導致菌種的污染和致病性減弱，當菌種數量較多時，菌種保存的工作量較大，易造成菌種的錯亂甚至丟失。因此，有必要建立一種簡單的快速分離和保存甘薯白絹病菌的方法。
技術實現思路
有鑒于此，本專利技術的目的在于提供一種簡單的快速分離鑒定和保存甘薯白絹病菌的方法。為了實現上述專利技術目的，本專利技術提供以下技術方案：本專利技術提供了一種快速分離鑒定甘薯白絹病菌的方法，包括以下步驟：1)在甘薯白絹病的病樣中挑取菌絲和/或菌核接種于PDA培養基平板，在20～30℃條件下進行培養，所述的甘薯白絹病的病樣為具有白色如白絹狀的菌絲和/或白色至棕褐色的油菜籽狀的菌核的甘薯薯塊或莖枝；2)培養出新的菌絲后，挑取新的菌絲到新的PDA培養基平板上，進行純化培養，純化培養長出新的菌絲后重復挑取新的菌絲至新的PDA培養基平板，多次重復培養得到純化的菌株，然后將純化的菌株培養8～12天，得到具有油菜籽狀菌核的菌株即為純化的疑似甘薯白絹病菌；3)將所述純化的疑似甘薯白絹病菌菌株在20～30℃培養2～4d后，從菌落上切取菌絲塊作為接種體接種至健康甘薯莖枝，在密封條件下，20～30℃培養1～3天，以PDA培養基塊作為空白對照，出現莖枝腐爛的現象確認接種到甘薯莖枝上的菌株為甘薯白絹病菌。優選的，步驟1)中所述的PDA培養基平板包括鏈霉素。優選的，_步驟1)中所述PDA培養基平板中鏈霉素的終濃度為15～25mg/L。優選的，鏈霉素是在步驟1)中所述的PDA培養基冷卻至50～60℃間加入的。優選的，所述的鏈霉素與PDA培養基的質量比為(0.05～0.2):100。優選的，步驟3)中所述的菌絲塊取自菌落邊緣0～20mm范圍內。優選的，所述的菌絲塊的直徑為4～8mm。優選的，步驟3)中所述的健康甘薯莖枝的長度為10～15cm，所述的健康甘薯莖枝平置于鋪有浸透無菌水的濾紙的密閉塑料盒內。優選的，步驟3)中所述的接種是將菌絲塊的有菌面貼住健康甘薯莖枝接種。本專利技術還提供了一種保存甘薯白絹病菌的方法，包括以下步驟：將甘薯白絹病菌轉接到新的PDA培養基平板上，20～30℃培養至平板上長出棕褐色的菌核，在無菌條件下，收集棕褐色的菌核；菌核干燥后放入-30℃～-20℃保存。本專利技術的有益效果：本專利技術所述的方法不需要進行酒精或升汞消毒，提高了病原菌分離效率，減少了有害物的處理；分離鑒定不需要特殊的儀器設備；鑒定速度快，接種兩天內就可確認是否為致病白絹病。本專利技術還提供了甘薯白絹病菌的保存方法，通過保存干燥的菌核可實現保存的菌種存活時間長，可達4年以上；本專利技術提供的保存方法工作量小，保藏菌種易管理。附圖說明圖1為本專利技術實施例1中甘薯白絹病菌培養3天的菌落狀態；圖2為本專利技術實施例中甘薯白絹病菌培養10天的菌落狀態。具體實施方式本專利技術提供了一種快速分離鑒定甘薯白絹病菌的方法，包括以下步驟：1)在甘薯白絹病的病樣中挑取菌絲或菌核接種于PDA培養基平板20～30℃進行培養，所述的甘薯白絹病的病樣為具有白色如白絹狀的菌絲和白色至棕褐色的油菜籽狀的菌核的甘薯；2)培養出新的菌絲后，挑取新的菌絲到新的PDA培養基平板上，進行純化培養，純化培養長出新的菌絲后重復挑取新的菌絲至新的PDA培養基平板，多次重復培養得到純化的菌株，然后將純化的菌株培養8～12天，得到具有油菜籽狀菌核的菌株即為純化的疑似甘薯白絹病菌；3)將所述純化的疑似甘薯白絹病菌菌株在20～30℃培養2～4d后，從菌落上切取菌絲塊作為接種體接種至健康甘薯莖枝，以PDA培養基塊作為空白對照，在密封條件下，20～30℃培養1～3天，出現莖枝腐爛的現象確認接種到甘薯莖枝上的菌株為甘薯白絹病菌。本專利技術優選在分離鑒定甘薯白絹病菌之前制備PDA培養基，本專利技術中所述的PDA培養基為本領域技術人員所熟知的PDA培養基，本專利技術對此沒有特殊的限制。本專利技術所述的PDA培養基優選的經過高溫滅菌，所述的高溫滅菌采用本領域所熟知的濕熱高溫滅菌即可，無其他特殊要求。本專利技術優選在對PDA培養基高溫滅菌后冷卻，優選在所述冷卻的過程中加入鏈霉素。優選的所述鏈霉素在PDA培養基冷卻至50～60℃，更優選的在PDA培養基冷卻至55℃時添加。在本專利技術中，所述PDA培養基中鏈霉素的濃度優選的為15～25mg/L，更優選的為20mg/L；所述鏈霉素與PDA培養基的質量比優選的為(0.05～0.2):100，更優選的為0.1:100。本專利技術在PDA培養基制備完成后，進行甘薯白絹病菌的分離：在甘薯白絹病的病樣中挑取菌絲或菌核接種于PDA培養基平板本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種快速分離鑒定甘薯白絹病菌的方法，包括以下步驟：1)從甘薯白絹病的病樣中挑取菌絲和/或菌核接種于PDA培養基平板，在20～30℃條件下進行培養，所述的甘薯白絹病的病樣為具有白色如白絹狀的菌絲和/或白色至棕褐色的油菜籽狀的菌核的甘薯薯塊或莖枝；2)培養出新的菌絲后，挑取新的菌絲到新的PDA培養基平板上，進行純化培養，純化培養長出新的菌絲后重復挑取新的菌絲至新的PDA培養基平板，多次重復培養得到純化的菌株，將所述純化的菌株培養8～12天，得到具油菜籽狀菌核的菌株即為純化的疑似甘薯白絹病菌；3)將所述純化的疑似甘薯白絹病菌菌株在20～30℃培養2～4d后，從菌落上切取菌絲塊作為接種體接種至健康甘薯莖枝，在密封條件下，20～30℃培養1～3天，以PDA培養基塊，作為空白對照，出現莖枝腐爛的現象確認接種到甘薯莖枝上的菌株為甘薯白絹病菌。

【技術特征摘要】
1.一種快速分離鑒定甘薯白絹病菌的方法，包括以下步驟：
1)從甘薯白絹病的病樣中挑取菌絲和/或菌核接種于PDA培養基平板，
在20～30℃條件下進行培養，所述的甘薯白絹病的病樣為具有白色如白絹狀
的菌絲和/或白色至棕褐色的油菜籽狀的菌核的甘薯薯塊或莖枝；
2)培養出新的菌絲后，挑取新的菌絲到新的PDA培養基平板上，進行
純化培養，純化培養長出新的菌絲后重復挑取新的菌絲至新的PDA培養基平
板，多次重復培養得到純化的菌株，將所述純化的菌株培養8～12天，得到具
油菜籽狀菌核的菌株即為純化的疑似甘薯白絹病菌；
3)將所述純化的疑似甘薯白絹病菌菌株在20～30℃培養2～4d后，從菌
落上切取菌絲塊作為接種體接種至健康甘薯莖枝，在密封條件下，20～30℃培
養1～3天，以PDA培養基塊，作為空白對照，出現莖枝腐爛的現象確認接種
到甘薯莖枝上的菌株為甘薯白絹病菌。
2.根據權利要求1所述快速分離鑒定甘薯白絹病菌的方法，其特征在于：
步驟1)中所述的PDA培養基平板包括鏈霉素。
3.根據權利要求2所述的快速分離鑒定甘薯白絹病菌的方法，其特征在
于：步驟1)中所述PDA培養基平板中鏈霉素的濃度為15～25mg/L。
4.根據權利要...

【專利技術屬性】
技術研發人員：黃立飛，房伯平，陳景益，葉芍君，黃實輝，
申請(專利權)人：廣東省農業科學院作物研究所，
類型：發明
國別省市：廣東;44