分子印記納米磁珠分散固相萃取與質譜聯用用于大鼠血漿中虎杖代謝物質群的檢測方法技術

本發明專利技術公開了一種基于分子印記納米磁珠分散固相萃取與LC/Q-TOF-MS技術聯用用于大鼠血漿中虎杖代謝物質群的檢測方法，步驟如下：1.制備印記磁珠，將制備好的印記磁珠加入到處理好的大鼠血漿中進行吸附，解析，收集解析液。將上述解析液氮氣吹干，用流動相和參考物染料木素復溶，利用LC/Q-TOF-MS對解析液進行半定量分析，鑒定中藥虎杖的代謝物質群。采用本發明專利技術方法可以針對生物樣品基質復雜的作用特點，通過富集代謝物質群，結合活性篩選，追溯中藥原形成分，揭示中藥虎杖“原形成分-代謝物質群-活性”的相關性，鑒定得到的目標代謝產物數量多，富集效果好。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種中藥虎杖代謝物質群的檢測方法，具體涉及一種基于分子印記納米磁珠分散固相萃取與LC/Q-TOF-MS技術聯用用于大鼠血漿中虎杖代謝物質群的檢測方法。
技術介紹
中藥代謝產物的研究獲得了全世界的廣泛關注，因其具有潛在的活性成分或生物標記物用于疾病診斷和治療反應。特別是目標代謝物群的研究，對闡明藥效物質基礎和中藥的有效成分具有重要意義。然而，由于中藥代謝產物群的成分多樣性，作用復雜性，基質背景干擾，且缺少適當的分析方法，這一部分的研究是遠遠不夠的。因此，對中藥目標代謝物群的研究迫切需要一種綜合的評價方法和先進的分析戰略。虎杖作為蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.etZucc.的干燥根莖和根，廣泛分布在亞洲和北美等地區。由于本身具有保肝降血脂、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等藥理作用，尤其抗腫瘤活性，常常被作為腫瘤類和心腦血管疾病的化學預防劑。虎杖中富含以反式白藜蘆醇苷(虎杖苷，polydatin)為代表的茋類和以大黃素(emodin)為代表的蒽醌類成分，在2010版中國藥典中采用高效液相色譜法對上述兩種指標成分進行質量控制。虎杖中的茋類成分主要為虎杖苷和反式白藜蘆醇(trans-resveratrol)，具有顯著的抗腫瘤、抗心腦血管疾病和神經保護的藥理活性。虎杖苷及其苷元在體內代謝產物多為其葡萄糖醛酸苷或硫酸酯類化合物，其代謝產物的藥理活性在不斷深入研究和報道。虎杖中大黃素類成分的體內代謝研究表明，大黃素主要以原型、大黃素-O-8-β-D葡萄糖苷(emodin–8-O-β-D-glucoside)、大黃酸或大黃素甲醚等形式存在，其代謝產物具有顯著的抑菌、保肝利膽、抗腫瘤和降血脂等藥理活性。但目前研究僅能對原型及主要代謝產物進行定性定量分析，缺乏對體內外物質組的整體認識，從而導致一些微量的代謝產物往往檢測不到或者丟失。為了更好地闡明其藥效物質基礎，需要一種選擇性強專屬性好的富集分離模式并建立基于整體觀的體內外物質組表征方法。目前，各種分析技術如LC-MS、LC-MS以及基于基質干擾、微量成分損失等問題相繼出現的蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取等樣品預處理技術，已逐漸應用于中藥代謝分析，但這些傳統方法具有選擇性低、干擾大、萃取效率低等缺點。因此，尋找一個有效的預處理方法和步驟對于減少干擾、提高靈敏度是至關重要的。近年來，具有構效預定性、選擇識別性和廣泛實用性特點的分子印記技術(molecularimprintingtechnology,MIT)發展迅速，分子印記聚合物(molecularimprintedpolymers,MIPs)對模板分子空間結構“記憶”效應和作用位點的“識別”作用，能夠高選擇性的分離富集復雜體系微量成分。MIT的基本過程包括：(1)印記模板分子與功能單體預聚合；(2)交聯劑固定模板分子周圍的預組裝結合基團；(3)除去模板分子，留下具有特定識別位點且三維結構匹配的空穴。由于MIPs具有選擇識別性、穩定性好及使用壽命長等優點，在環境分析、生物傳感器等許多領域得到應用。且研究表明，MIPs不僅可對模板分子選擇性識別，而且對結構類似物亦具有較好的親和力和選擇識別性。MIPs用于中藥體內復雜代謝成分的高選擇性分離和檢測研究具有令人矚目的廣闊前景。磁性分離技術是當今在生物化學和生物醫學工程領域中發展起來一種新的分離技術。是基于磁性微球在外磁場作用下的磁泳運動，從而對目標物進行分離富集的技術，具有快速、高效、非玷污、集分離富集于一體等諸多優點。磁分離技術所面臨的關鍵問題在于粒徑大小均一、水中分散性好、磁響應性強、超順磁性磁性材料的制備，以保證生物分離過程的重現性、可控性和高效性。本論文通過制備出具有高磁響應性的磁性納米粒，為MIPs的制備省去離心、過濾等繁雜的操作，使其更加省時、方便。未經修飾的磁性納米粒表面因其缺少官能基團使其應用大大受到限制，對其進行樹枝狀分子修飾后，可獲得高度枝化的三維結構，其結構含有眾多具有相同微環境的端基官能團和非纏繞鏈段，可對樹枝狀聚合物進行各種端基改性，以滿足多種應用需求。樹枝狀結構有良好的可控制性、高度的分枝、豐富的功能基團，與傳統的線型聚合物相比，提供了較大的比表面積，這為MIPs的制備提供了較多的印記位點。針對中藥虎杖代謝產物的主要活性成分，專利技術人通過表面分子印記技術和磁性分離技術的交叉研究，制備出對虎杖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷具有高靈敏度、高選擇性印記磁珠，針對中藥體內代謝物質結構特點，采用相應的印記磁珠“垂釣”體內代謝物質群，實現中藥虎杖總提取物給藥后的“多靶標富集”，對目標群進行LC/Q-TOF-MS的鑒定與分析，這與傳統的有效部位給藥后分析代謝物質的方法相比，更充分考慮中藥整體(包括復雜的基質背景)作用的特點，有望揭示虎杖“原型成分-代謝物質群-活性”的相關性，為中藥代謝物質群的研究建立了一個有效的分析平臺。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服上述不足之處，提供一種基于分子印記納米磁珠分散固相萃取(MMIPs-DSPE)與LC/Q-TOF-MS技術聯用用于大鼠血漿中虎杖代謝物質群的檢測方法。本專利技術的目的是通過以下方式實現的：一種基于分子印記納米磁珠分散固相萃取(MMIPs-DSPE)與LC/Q-TOF-MS技術聯用用于大鼠血漿中虎杖代謝物質群的檢測方法，其特征在于該方法包括以下步驟：(1)制備印記磁珠：a).將Fe3O4SiO2納米粒分散于甲苯中，加入硅烷偶聯劑，氮氣條件下加熱回流12～48h，經磁性分離后，洗滌，真空干燥；氮氣保護下，以甲醇為溶劑，依次與丙烯酸甲酯和乙二胺各反應1次，每次反應24～36h，得到納米磁珠Fe3O4EDA；b)將Fe3O4EDA分散于甲醇溶液，加入三羥甲基丙烷三丙烯酸酯(TMPTA)，氮氣條件下加熱回流6～36h，經磁性分離后，洗滌，真空干燥，得Fe3O4TMPTA；c).將模板分子虎杖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷分別和Fe3O4TMPTA置于致孔劑中室溫下預聚1-2h，再加入甲基丙烯酸室溫預聚0.5～2h，最后加入交聯劑及引發劑，氮氣保護下，依次在50℃下聚合6-24h后，60℃下聚合12-24h；d).所得聚合物分別用體積比為1:5-9的醋酸甲醇混合溶液洗脫模板分子，干燥，得到虎杖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷分子印記磁珠，分別記為PD-MMIPs、EG-MMIPs；(2)樣品處理：按照給藥量為4.0g/kg大鼠給藥中藥虎杖浸膏后，分別于給藥后0分鐘，5分鐘，10分鐘，30分鐘，60分鐘，90分鐘，120分鐘，180分鐘取血樣，將血樣分別放于含有抗凝劑的小管中，離心后取上清液得血漿，將每份樣品取出相同的量制成混合血漿；隨后混合血漿處理如下：取兩份混合血漿，分別加入其3倍體積的甲醇，經渦旋、離心，分別取上清液氮氣吹干，溶劑復溶，再分別加入PD-MMIPs和EG-MMIPs印記磁珠振搖，磁性分離，棄去上清液，甲醇洗去殘留溶液后，加入解析溶液超聲30分鐘解析模板分子；優選渦旋振蕩1分鐘、15000r/min離心10分鐘。(3)樣品本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于分子印記納米磁珠分散固相萃取與LC/Q?TOF?MS技術聯用用于大鼠血漿中虎杖代謝物質群的檢測方法，其特征在于該方法包括以下步驟：(1)制備印記磁珠：將Fe3O4@SiO2納米粒分散于甲苯中，加入硅烷偶聯劑，氮氣條件下加熱回流12～48h，經磁性分離后，洗滌，真空干燥；氮氣保護下，以甲醇為溶劑，依次與丙烯酸甲酯和乙二胺各反應1次，每次反應24～36h，得到納米磁珠Fe3O4@EDA；將Fe3O4@EDA分散于甲醇溶液，加入三羥甲基丙烷三丙烯酸酯，氮氣條件下加熱回流6～36h，經磁性分離后，洗滌，真空干燥，得Fe3O4@TMPTA；將模板分子虎杖苷、大黃素?8?O?β?D?葡萄糖苷分別和Fe3O4@TMPTA置于致孔劑中室溫下預聚1?2h，再加入甲基丙烯酸室溫預聚0.5～2h，最后加入交聯劑及引發劑，氮氣保護下，依次在50℃下聚合6?24h后，60℃下聚合12?24h；所得聚合物分別用體積比為1:5?9的醋酸甲醇混合溶液洗脫模板分子，干燥，得到虎杖苷、大黃素?8?O?β?D?葡萄糖苷分子印記磁珠，分別記為PD?MMIPs、EG?MMIPs；(2)樣品處理：按照給藥量為4.0g/kg大鼠給藥中藥虎杖浸膏后，分別于給藥后0分鐘，5分鐘，10分鐘，30分鐘，60分鐘，90分鐘，120分鐘，180分鐘取血樣，將血樣分別放于含有抗凝劑的小管中，離心后取上清液得血漿，將每份樣品取出相同的量制成混合血漿；隨后混合血漿處理如下：取兩份混合血漿，分別加入其3倍體積的甲醇，經渦旋、離心，分別取上清液氮氣吹干，溶劑復溶，再分別加入PD?MMIPs和EG?MMIPs印記磁珠振搖，磁性分離，棄去上清液，甲醇洗去殘留溶液后，加入解析溶液超聲30分鐘解析模板分子；(3)樣品分析：分別將上述得到的解析液氮氣吹干，復溶，利用LC/Q?TOF?MS對解析液進行半定量分析，鑒定中藥虎杖的代謝物質群。...

【技術特征摘要】
1.一種基于分子印記納米磁珠分散固相萃取與LC/Q-TOF-MS技術聯用用于大鼠血漿中
虎杖代謝物質群的檢測方法，其特征在于該方法包括以下步驟：
(1)制備印記磁珠：將Fe3O4SiO2納米粒分散于甲苯中，加入硅烷偶聯劑，氮氣條件
下加熱回流12～48h，經磁性分離后，洗滌，真空干燥；氮氣保護下，以甲醇為溶劑，依
次與丙烯酸甲酯和乙二胺各反應1次，每次反應24～36h，得到納米磁珠Fe3O4EDA；
將Fe3O4EDA分散于甲醇溶液，加入三羥甲基丙烷三丙烯酸酯，氮氣條件下加熱回流6～
36h，經磁性分離后，洗滌，真空干燥，得Fe3O4TMPTA；將模板分子虎杖苷、大黃素
-8-O-β-D-葡萄糖苷分別和Fe3O4TMPTA置于致孔劑中室溫下預聚1-2h，再加入甲基丙
烯酸室溫預聚0.5～2h，最后加入交聯劑及引發劑，氮氣保護下，依次在50℃下聚合6-24h
后，60℃下聚合12-24h；所得聚合物分別用體積比為1:5-9的醋酸甲醇混合溶液洗脫模板
分子，干燥，得到虎杖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷分子印記磁珠，分別記為PD-MMIPs、
EG-MMIPs；
(2)樣品處理：按照給藥量為4.0g/kg大鼠給藥中藥虎杖浸膏后，分別于給藥后0分鐘，
5分鐘，10分鐘，30分鐘，60分鐘，90分鐘，120分鐘，180分鐘取血樣，將血樣分別放
于含有抗凝劑的小管中，離心后取上清液得血漿，將每份樣品取出相同的量制成混合血漿；
隨后混合血漿處理如下：取兩份混合血漿，分別加入其3倍體積的甲醇，經渦旋、離心，
分別取上清液氮氣吹干，溶劑復溶，再分別加入PD-MMIPs和EG-MMIPs印記磁珠振搖，
磁性分離，棄去上清液，甲醇洗去殘留溶液后，加入解析溶液超聲30分鐘解析模板分子；
(3)樣品分析：分別將上述得到的解析液氮氣吹干，復溶，利用LC/Q-TOF-MS對解析
液進行半定量分析，鑒定中藥虎杖的代謝物質群。
2.根據權利要求1所述的基于分子印記納米磁珠分散固相萃取與LC/Q-TOF-MS技術聯用
用于大鼠血漿中虎杖代謝物質群的檢測方法，其特征在于步驟(3)中進行半定量分析采
用的條件為：
高效液相條件：流動相A：0.05％甲酸水溶液；流動相B：甲醇溶液；色譜柱型號：
HederaODS-2C18column(4.6×250mm,5μm)；梯度條件：0-10min,30-40％B；10-25min,
40-60％B；25-45min,60-80％B；45-60min,80-85％B或者0–5min,15–25％B；5–15min,
25–35％B；15–25min,35–60％B；25–45min,60–70％B；45-60min,70-100％B或者0-15
min,15-35％B；15-25min,35-60％B；25-45min,60-70％B；45-6...

【專利技術屬性】
技術研發人員：周學敏，洪俊麗，楊載月，蔡奇志，陳寧，
申請(專利權)人：南京醫科大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32