一種利用重組光滑鱉甲抗凍蛋白對綿羊體外胚胎進行冷凍的方法技術

本發(fā)明專利技術屬于生物工程技術領域，具體涉及一種利用重組光滑鱉甲抗凍蛋白對綿羊體外胚胎進行冷凍保護的方法,該方法包括步驟如下：（1）獲取綿羊卵巢；（2）撿出卵母細胞；（3）加入裝有體外受精液的液滴內(nèi)，備用；（4）將解凍后的凍精加入步驟（3）的體外受精液滴中與卵母細胞孵育；（5）取出早期胚胎培養(yǎng)，統(tǒng)計囊胚率；（6）囊胚在添加ApAFP的冷凍液VS1和VS2中處理，最后裝管液氮保存即可。通過這種方法能顯著提高綿羊冷凍胚胎解凍后的存活率。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

【技術保護點】
一種利用重組光滑鱉甲抗凍蛋白對綿羊體外胚胎進行冷凍保護的方法，其特征在于：該方法包括步驟如下：（1）獲取宰殺后30分鐘以內(nèi)的綿羊卵巢，置入溫度在30?35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml鏈霉素的生理鹽水中，3小時內(nèi)用生理鹽水清洗3?4次；（2）然后，用吸有2ml抽卵液的注射器抽吸卵巢表面2?5mm大小的卵泡，將注射器內(nèi)回收的卵泡液置于器皿中，在顯微鏡下?lián)斐雎涯讣毎皿w外成熟液洗滌3?5次，備用；（3）將步驟（2）中撿出的卵母細胞，在條件為5%?CO2，95%空氣，溫度為38.6℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)22?24小時，用綿羊體外受精液洗滌2?4次，按25?30枚/滴的密度加入裝有體外受精液的液滴內(nèi)，備用；（4）將解凍后的凍精，加入裝有體外受精液的試管底部，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)上游20?25分鐘，取上層精子混懸液，以1500轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心4?5分鐘，然后棄去上清液，用剩余的精子沉淀進行密度計算，按2?4×106個/ml的密度加入步驟（3）的體外受精液滴中與卵母細胞共同孵育；（5）將步驟（4）中受精20?22小時的早期胚胎取出，移至體外培養(yǎng)液IVC內(nèi)洗滌3?4次，并再次培養(yǎng)24?26小時，將未卵裂卵母細胞剔除，統(tǒng)計卵裂率，并繼續(xù)培養(yǎng)，144?168小時后統(tǒng)計囊胚率；（6）將步驟（5）中獲得的囊胚用冷凍基礎液洗滌3遍，在添加ApAFP的冷凍液VS1中平衡5分鐘，在添加ApAFP?914的冷凍液VS2中處理30秒，裝管進行液氮保存即可。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：汪立芹，毛新芳，吳陽升，劉忠淵，林嘉鵬，黃俊成，史洪才，杜榮俸，
申請(專利權)人：新疆畜牧科學院生物技術研究所新疆畜牧科學院中國澳大利亞綿羊育種研究中心，新疆大學，
類型：發(fā)明
國別省市：新疆;65