結核菌群的免疫學檢測方法和試劑盒技術

本發明專利技術涉及結核菌群的免疫學檢測方法和試劑盒。[課題]由于用于檢測結核菌群的常規方法需要時間長且還需要大量勞力和費用，因此還不能進行結核病的確定診斷和早期治療開始。已存在對快速檢測方法的需求。即使對于從生物樣品直接檢測，如果生物樣品中不存在MPT64或僅存在非常少量的MPT64，也不能進行檢測。結果已產生結核菌群感染被忽略的風險，并且更可靠的檢測方法十分必要。[解決方法]提供一種方法和試劑盒，其中加熱處理施加至含有結核菌群的生物樣品，從而使結核菌群特異的分泌蛋白質，特別是MPB64，分泌到細菌細胞外，并將得到的處理樣品進行免疫學測定，從而在不培養生物樣品的情況下以更迅速且簡便的方式檢測結核菌群。

【技術實現步驟摘要】
結核菌群的免疫學檢測方法和試劑盒本申請是2014年10月8日進入中國的申請號為201380018968.0(PCT/JP2013/060301，國際申請日2013年4月4日)的專利申請“結核菌群的免疫學檢測方法和試劑盒”的分案申請。
本專利技術涉及高度安全的結核菌群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex)的免疫學檢測方法和試劑盒，其通過在預定的溫度下加熱處理生物樣品并免疫學檢測由此被細胞外分泌(extracellularlysecreted)的結核菌群特異的分泌蛋白質，可在不進行培養操作的情況下由含有結核菌群的生物樣品直接簡便且迅速地進行。
技術介紹
結核(Tuberculosis)為目前高度重要的傳染病，據稱每年日本國內有數千人、世界各地有數百萬人死于該疾病，根據傳染病法(InfectiousDiseaseLaw)疑似結核感染的患者必須入院。當診斷患者患有結核時醫師必須立即報告給當局，因而需要及時的響應。屬于結核菌群的結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，人型結核菌)、牛結核分枝桿菌(Mycobacteriumbovis，牛型結核菌)、鼠結核分枝桿菌(Mycobacteriummicroti，鼠型結核菌)和非洲結核分枝桿菌(Mycobacteriumafricanum，非洲型結核菌)已知為對人類致病的抗酸菌(acid-fastbacteria)。鳥結核分枝桿菌(Mycobacteriumavium)、堪薩斯結核分枝桿菌(Mycobacteriumkansasii)和海魚結核分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)等已知為非結核性分枝桿菌(non-tuberculousmycobacteria)。感染有結核菌群的人類主要由結核分枝桿菌引起，在某些罕見病例中，由牛結核分枝桿菌引起。近年來，非結核性分枝桿菌種中，感染有鳥結核分枝桿菌的病例增加。由于這兩類感染存在類似的臨床癥狀，病因細菌的鑒定對于確定治療方針也是重要的。因此，結核感染或非結核性分枝桿菌感染的區別檢測對于減輕患者負擔和適當地進行早期治療同樣是重要的。在另一方面，從公共衛生的角度，區別檢測對于防止第三人繼發感染的目的也是重要的。迄今為止，作為檢測結核菌群的方法，已實施了基于培養的檢測方法。此類培養方法通過將待試驗的生物樣品接種至液體培養基或固體培養基并檢測生長的細菌細胞來進行。盡管使用液體培養基的方法可縮短待試驗的生物樣品的培養期，但該方法在操作期間具有繼發感染的高風險，因而需要高度安全的設備和裝置。使用固體培養基的方法需要長達大約2個月的時間才能獲得檢測結果。結核菌群必須使用高度安全的裝置在高度安全的環境中特別小心地培養以防止繼發感染。作為用于從上述培養的生物樣品的培養基中鑒定結核菌群的方法，已知涉及免疫學測定分泌至培養基中的結核菌群特異的蛋白質的簡便檢測方法。日本專利特開平11-108931號公報公開了用于檢測結核菌群存在的方法，該方法包括：將從結核病患者收集的生物樣品接種至固體培養基或液體培養基，培養結核菌群數日至數周；然后免疫學檢測分泌至培養基中的結核菌群特異的分泌蛋白質MPB64。根據該文獻，該方法與常規方法相比允許在培養后立即鑒定和檢測結核菌群并減少操作期間繼發感染的風險。然而，該方法涉及培養包含在生物樣品中的結核菌群，并使用得到的培養物作為樣品。因此，該方法需要與直至結核菌群被檢測和鑒定的培養期幾乎相同的時間，因而需要大量勞力和費用。如日本專利特開平11-108931號公報所述，MPB64為牛結核分枝桿菌BCG(M.bovisBCG)產生并被細胞外分泌的結核菌群特異的分泌蛋白質。MPT64為結核分枝桿菌產生并被細胞外分泌的結核菌群特異的分泌蛋白質。MPB64和MPT64已知為相同的物質。日本專利特開2002-62299號公報指出，結核菌群特異的分泌蛋白質MPT64可在不培養包含在生物樣品中的結核菌群的情況下通過免疫學測定來檢測。該方法涉及處理生物樣品如痰并檢測包含在生物樣品中的MPT64，從而檢測結核菌群的存在。然而，即使結核菌群存在于生物樣品中，除非MPB64由結核菌群被細胞外分泌并包含在生物樣品中，否則該方法也不能檢測出結核菌群。另外，豐度小的MPT64，即使分泌也需要大量的生物樣品并使操作復雜化。該操作增加了試驗對象和負責試驗人員的負擔。同時，可能會忽略結核菌群的感染，導致公共衛生問題。國際公開WO2009/084481號公開了一種更快速、更安全且比以往更精確地診斷結核菌感染的方法，該方法包括使用抗MPB64中特定表位的抗體特異地檢測生物樣品中的MPB64。根據該方法，可應用的樣品可為通過使用少量液體培養基僅在結核菌群的細菌細胞實質上開始生長之前的一段時間內培養生物樣品獲得的培養物。然而，該方法仍需要促進MPB64從生長前的細菌細胞分泌以使大量MPB64在培養基中累積的方法。現有技術文獻專利文獻專利文獻1：日本專利申請特開平11-108931號公報專利文獻2：日本專利申請特開2002-62299號公報專利文獻3：國際公開WO2009/084481號
技術實現思路
專利技術要解決的問題如上所述，常規方法需要長時間檢測結核菌群還需要大量勞力和費用。出于這些原因，結核的確定診斷和早期治療開始不能進行。因此，已存在對快速檢測方法的需求。另外，如果生物樣品不含有MPT64或含非常少量的MPT64，也不能進行生物樣品的直接檢測。結果，結核菌群感染可能被忽略。因此，需要更可靠的檢測方法。本專利技術的目的為通過提供簡便、快速且更可靠的結核菌群檢測方法來解決這些問題。用于解決問題的方案本專利技術人已進行了孜孜不倦的研究來解決上述問題，因此發現該問題可通過加熱處理含有結核菌群的生物樣品以便細胞外分泌結核菌群特異的分泌蛋白質如MPB64并檢測由此分泌的蛋白質來解決，結果，已完成了本專利技術。根據一個方面，本專利技術提供一種結核菌群的檢測方法，其包括使結核菌群特異的蛋白質進行免疫學測定，其中所述蛋白質通過使含有結核菌群的生物樣品進行加熱處理而被細胞外分泌。根據另一方面，本專利技術還提供一種結核菌群檢測用試劑盒，作為出于進行上述方法的目的的結核菌群檢測用試劑盒，其至少包括使含有結核菌群的生物樣品進行加熱處理的處理容器，和用于檢測通過加熱處理分泌的結核菌群特異的分泌蛋白質的免疫學測定裝置。該試劑盒可進一步包括樣品處理劑和/或溶劑。本專利技術的檢測方法和試劑盒能夠快速且簡便地檢測結核菌群。根據另外的方面，本專利技術還提供用于細胞外分泌結核菌群特異的蛋白質的方法，其包括使含有結核菌群的生物樣品進行加熱處理。附圖說明圖1為示出當使用M.bovisBCG東京菌株的細菌細胞時加熱處理溫度與促進細胞外MPB64分泌的效果之間關系的圖。圖2為示出當使用M.bovisBCG東京菌株的細菌細胞時加熱處理時間與促進細胞外MPB64分泌的效果之間關系的圖。具體實施方式用于本專利技術的生物樣品不特別限定，只要生物樣品可含有結核菌群即可。生物樣品的實例包括痰、胸膜積液、支氣管分泌物、胃液、血液、脊髓液、尿液和排泄物。優選地，使用痰是因為其細菌濃度高。可選地，呼吸檢查期間收集的支氣管灌洗液或收集自支氣管或肺的組織等可用作生物樣品。這些生物樣品本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種結核菌群的檢測方法，其中所述結核菌群產生被細胞外分泌的結核菌群特異的蛋白質，所述方法包括使所述結核菌群特異的蛋白質進行免疫學測定，其中所述蛋白質通過使含有所述結核菌群的生物樣品進行40℃至60℃至少15分鐘的加熱處理而被細胞外分泌。

【技術特征摘要】
2012.04.05 JP 2012-0865661.一種抗體在制備通過下述方法來檢測結核菌群的試劑中的用途，其中所述結核菌群產生被細胞外分泌的結核菌群特異的蛋白質，所述方法包括使所述結核菌群特異的蛋白質進行免疫學測定，其中所述蛋白質通過使含有所述結核菌群的生物樣品進行40℃至60℃至少15分鐘的加熱處理而被細胞外分泌，和所述抗體為抗所述結核菌群特異的分泌蛋白質的抗體。2.根據權利要求1所述的用途，其中所述生物樣品的所述加熱處理在40℃至55℃下進行。3.根據權利要求1所述的用途，其中所述生物樣品的所述加熱處理進行15分鐘以上且2.5小時以下。4.根據權利要求1所述的用途，其中所述生物樣品為選自由痰、支氣管分泌物、胸膜積液、胃液、血液、脊髓液、排泄物、支氣管灌洗液和收集自支氣管或肺的組織組成的組的至少一種樣品。5.根據權利要求4所述的用途，其中所述排泄物為尿液。6.根據權利要求4所述的用途，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：野中浦雄，北川俊之，
申請(專利權)人：株式會社比爾生命，
類型：發明
國別省市：日本;JP