本發(fā)明專利技術(shù)涉及能夠高效降解阿特拉津的伯克霍爾德氏菌和叢毛單胞菌，通過響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)獲得了高密度細(xì)胞培養(yǎng)的混合發(fā)酵培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)方法，具體為一種高效降解阿特拉津的混合菌及該混合菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法。該發(fā)明專利技術(shù)是使用能夠高效降解阿特拉津的伯克霍爾德氏菌和叢毛單胞菌，通過響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)獲得了高密度細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方：蔗糖6.72g，葡萄糖6.75g，豆粕粉6.34g，磷酸氫二鉀0.6g，磷酸二氫鉀2.5g，七水硫酸鎂0.3g，氯化鈉0.4g，酵母粉3g，蒸餾水1L，pH7.0?7.5。利用培養(yǎng)的混合菌液進(jìn)行土壤修復(fù)試驗(yàn)，7天內(nèi)200mg·L?1的阿特拉津降解完全。本發(fā)明專利技術(shù)為該混合菌的開發(fā)提供了高密度發(fā)酵培養(yǎng)配方及方法。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及能夠高效降解阿特拉津的伯克霍爾德氏菌和叢毛單胞菌，通過響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)獲得了高密度細(xì)胞培養(yǎng)的混合發(fā)酵培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)方法，具體為一種高效降解阿特拉津的混合菌及該混合菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法。
技術(shù)介紹
阿特拉津，又名莠去津(阿特拉津atrazine，阿特拉津)，其特點(diǎn)是含有苯環(huán)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、水溶性低、吸附系數(shù)小、殘效期長。目前，由于長期廣泛的使用，給環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染。因此，研究阿特拉津的降解具有重要意義。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)在自然界中存在著大量的具有很強(qiáng)適應(yīng)能力微生物，它們通過各種代謝途徑把各類農(nóng)藥完全礦化或降解成無毒的成分，同時(shí)又不會(huì)對環(huán)境造成破壞。目前，已有多種阿特拉津降解菌種被分離。通過分子生物手段對分離菌種進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，阿特拉津降解的細(xì)菌主要有不動(dòng)桿菌屬、土壤桿菌屬、節(jié)桿菌屬等。國外的報(bào)道證明假單胞菌屬和節(jié)桿菌對阿特拉津的礦化有重要作用。李慧等利用一種革蘭氏陰性陰溝腸桿菌制成菌劑，可以使阿特拉津降解87％以上。有專利將陰溝腸桿菌發(fā)酵獲得固體或液體的阿特拉津降解菌劑，發(fā)酵液菌數(shù)達(dá)10億/mL以上(專利號：200710012981.1)；專利2014108397298(申請?zhí)?公布了產(chǎn)脲節(jié)桿菌Arthrobacterureafaciensliulou(CGMCCNo.9667)修復(fù)污染土壤及保護(hù)作物免受阿特拉津藥害的使用方法。使用微生物制劑降解阿特拉津的研究有所進(jìn)展，但是使用的多為單種菌種，對于幾種微生物共同培養(yǎng)降解阿特拉津的研究還很少。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于針對上述存在的問題，提供一種高效降解阿特拉津的混合菌，為伯克霍爾德氏菌和叢毛單胞菌的混合菌；以及一種共同培養(yǎng)降解阿特拉津的混合發(fā)酵方法，具體為一種伯克霍爾德氏菌和叢毛單胞菌的最優(yōu)混合發(fā)酵方法。一種高效降解阿特拉津的混合菌，為伯克霍爾德氏菌和叢毛單胞菌的混合菌。本專利技術(shù)涉及的菌種為：伯克霍爾德氏菌為伯克氏菌屬，LH-ZY01，拉丁文名稱：Burkholderiasp.，2012年12月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CCTCCNo.M2012536，保藏單位地址：中國武漢武漢大學(xué)，郵編430072，該菌為革蘭氏陰性桿菌，富有運(yùn)動(dòng)性及好氧性短桿狀的細(xì)菌。在保存培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成較小的圓形菌落，黃色。叢毛單胞菌(Comamonassp.)A2，分離自農(nóng)藥下水道污泥(Yangetal.,2008)：革蘭氏陰性桿菌，不形成芽孢，好氧菌。在保存培養(yǎng)基上形成較小的圓形菌落，白色至淺黃色。在2010年“Biodegradation”雜志中進(jìn)行了公開和記載。上述兩種菌種經(jīng)分離純化后接種到斜面培養(yǎng)基上，于4℃條件下保存。保存培養(yǎng)基配方LB培養(yǎng)基：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水1L，pH7.0-7.5，制成斜面培養(yǎng)基。一種高效降解阿特拉津的混合菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法，具體步驟為：將伯克霍爾德氏菌和叢毛單胞菌分別制備成種子液，按10％接種量等比例共同接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床30℃、180r/min，培養(yǎng)24h，得到發(fā)酵液。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：蔗糖6.72g，葡萄糖6.75g，豆粕粉6.34g，磷酸氫二鉀0.6g，磷酸二氫鉀2.5g，七水硫酸鎂0.3g，氯化鈉0.4g，酵母粉3g，蒸餾水1L，pH7.0-7.5。所述的種子液的制備方法為：將固體斜面上的菌種，各挑取一環(huán)分別接種到液體種子培養(yǎng)基中，搖床30℃、180r/min，培養(yǎng)18h。液體種子培養(yǎng)基配方為：葡萄糖5g，酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水1L，pH7.0-7.5。本專利技術(shù)的有益效果為：本專利技術(shù)通過優(yōu)選菌種，得到了優(yōu)良菌種的混合菌，并通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵方法，為該混合菌的開發(fā)提供了高密度發(fā)酵培養(yǎng)配方及方法，并對液體種子培養(yǎng)基配方等進(jìn)行創(chuàng)新，獲得發(fā)酵液的總菌數(shù)為102億/mL，其中伯克霍爾德氏菌菌數(shù)為62億/mL，叢毛單胞菌菌數(shù)為40億/mL。滅菌土和自然土中添加降解菌液后3d的降解率分別為63.8％和61.9％，而7d后降解率可達(dá)100％，具體可見試驗(yàn)例7。因此該菌液在土壤修復(fù)中具有較強(qiáng)的阿特拉津降解能力，顯示其具有較大的土壤修復(fù)潛力和應(yīng)用價(jià)值。總之，本專利技術(shù)使用能高效降解阿特拉津的兩種菌種進(jìn)行共培養(yǎng)，并且得到了能使兩種菌共同良好生長的優(yōu)化配方和培養(yǎng)方法，為高效降解阿特拉津復(fù)合微生物研究提供了重要的理論與實(shí)踐意義。附圖說明圖1為試驗(yàn)例4的最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果；圖2蔗糖與豆粕粉交互影響響應(yīng)面；圖3豆粕粉與葡萄糖交互影響響應(yīng)面；圖4蔗糖與葡萄糖交互影響響應(yīng)面。具體實(shí)施方式下面通過具體實(shí)施例對本專利技術(shù)的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的說明。試驗(yàn)例1：菌種保存酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水1L，pH7-7.5。制成固體斜面，將伯克霍爾德氏菌(Burkholderiasp.)LH-ZY01和叢毛單胞菌(Comamonassp.)A2分別保存于斜面上。試驗(yàn)例2：種子液的制備將固體斜面上的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiasp.)LH-ZY01.和叢毛單胞菌(Comamonassp.)A2各挑取一環(huán)分別接種到液體種子培養(yǎng)基中，搖床30℃、180r/min，培養(yǎng)18h。液體種子培養(yǎng)基配方為：葡萄糖5g，酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水1L，pH7-7.5。試驗(yàn)例3：Plackett-Burman試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)配方試驗(yàn)選用了7個(gè)成分的高低水平進(jìn)行顯著影響效應(yīng)分析，如表1。用Plackett-Burman設(shè)計(jì)12組試驗(yàn)，如表2。同時(shí)各試驗(yàn)組中均含有基礎(chǔ)鹽為：磷酸氫二鉀0.6g，七水硫酸鎂0.3g，磷酸二氫鉀2.5g，氯化鈉0.4g，蒸餾水1L，pH7-7.5。將兩種菌的種子液按10％接種量等比例共同接種到以下12組培養(yǎng)基中，搖床30℃、180r/min，培養(yǎng)24h。600nm下分光光度計(jì)測量OD值，試驗(yàn)均設(shè)立3個(gè)平行。表1分析因素及水平表2分析方案及試驗(yàn)結(jié)果由表2可以看出，不同培養(yǎng)基組成對發(fā)酵結(jié)果有比較顯著的影響。運(yùn)用Minitab軟件對表2進(jìn)行回歸分析，獲得以下回歸方程：OD＝-4.10+0.5547葡萄糖+0.7193蔗糖+0.0597淀粉+0.318蛋白胨+0.390酵母粉+1.292豆粕粉+0.043氯化銨。可以看出，在這7個(gè)因素的主效應(yīng)中，豆粕粉、蔗糖和葡萄糖為影響最為顯著的因素。試驗(yàn)例4：最陡爬坡試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)配方選用Plackett本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種高效降解阿特拉津的混合菌，為伯克霍爾德氏菌和叢毛單胞菌的混合菌。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種高效降解阿特拉津的混合菌，為伯克霍爾德氏菌和叢毛單胞菌的混合菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效降解阿特拉津的混合菌，其特征在于，伯克霍爾德氏菌為
伯克氏菌屬，LH-ZY01，拉丁文名稱：Burkholderiasp.，2012年12月18日保藏于中國典型培
養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CCTCCNo.M2012536，該菌為革蘭氏陰性桿菌，富有運(yùn)動(dòng)性及
好氧性短桿狀的細(xì)菌，在保存培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成較小的圓形菌落，黃色。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效降解阿特拉津的混合菌，其特征在于，將伯克霍爾德氏菌
接種到斜面培養(yǎng)基上，于4℃條件下保存；保存培養(yǎng)基配方LB培養(yǎng)基：酵母粉5g，蛋白胨10g，
氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水1L，pH7.0-7.5，制成斜面培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效降解阿特拉津的混合菌，其特征在于，將叢毛單胞菌接種
到斜面培養(yǎng)基上，于4℃條件下保存；保存培養(yǎng)基配方LB培養(yǎng)基：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化
鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水1L，pH7.0-7.5，制成斜面培...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：黃道跟，張娟，楊春玉，高超，
申請(專利權(quán))人：山東魯虹肥料研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：山東;37
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