一種具有抗菌活性的非蛋白質氨基酸及其制備方法技術

本發明專利技術涉及一種具有抗菌活性的非蛋白質氨基酸及其制備方法，所述非蛋白質氨基酸為7?amino?4?hydroxyoct?2?enoic?acid，分子式為C8H15NO3，結構式如下：。本發明專利技術制備的非蛋白質氨基酸對枯草芽孢桿菌有較好的抑制作用，可以利用菌株Paecilomyces?gunnii發酵制得，培養基原料來源廣泛，制備方法簡單，容易實現工業化生產。

【技術實現步驟摘要】


本專利技術涉及一種具有抗菌活性的非蛋白質氨基酸及其制備方法，屬于生物醫藥領域。

技術介紹

大型真菌不但具有豐富的營養價值，也可產生豐富的藥用活性物質，如具有抗細菌、促進神經生長因子合成、酶抑制劑、抗真菌、細胞毒、受體拮抗劑和抗氧化等多種生物活性多糖類、多肽、抗生素類、抗腫瘤等活性。大型真菌中具有抗菌活性的天然產物主要是倍半萜、二萜糖苷和多炔類等化合物。Agrocybolacton是從田蘑分離的drimane型骨架倍半萜，對革蘭氏陽性菌具有抑制作用。IlludinM和illudinS是從杯傘分離的倍半萜，它們對Staphylococcusaureus、Klebsiellapneumoniae、Mycobacteriumtuberculosis和Mycobacteriumsmega等病原菌的MIC值都在10μg/mL以下。從猴頭菌菌絲體分離的二萜糖苷erinacineE可抑制耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)，MIC值為62.5μM。Diatrenenitrile是從Clitocybediatreta分離的三炔類化合物，對Micrococcuspyogenes有較強的抑制作用，MIC值僅為0.1μg/mL。CinnatriacetinA和cinnatriacetinB是從牛舌菌子實體分離的三炔類化合物具有抗細菌活性。因此大型真菌是抗菌活性物質的重要來源。古尼擬青霉是古尼蟲草的無性型真菌，具有許多重要的生物活性。細菌性病害是人類健康的主要威脅，尋找安全有效的抗菌藥物是人類長期的目標。基于以上背景，開展本專利技術的研究。
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技術實現思路

本專利技術的目的在于提供一種具有抗菌活性的非蛋白質氨基酸及其制備方法。
本專利技術的另一目的在于將該非蛋白質氨基酸作為抗菌藥物。
一種具有抗菌活性的非蛋白質氨基酸，所述非蛋白質氨基酸為7-amino-4-hydroxyoct-2-enoicacid，分子式為C8H15NO3，結構式如下：
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所述具有抗菌活性的非蛋白質氨基酸的前體，所述化合物前體分子式為C20H30N4O5，結構式如下：
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本專利技術所述結構新穎的非蛋白質氨基酸制備方法包括：
1)真菌液體發酵：將真菌古尼擬青霉(Paecilomycesgunnii）（參考文獻:古尼擬青霉液體發酵液有機粗提物產量的研究，生物技術，2012，22（1）：88-89）斜面菌種活化后，進行液體深層發酵，培養基配方按重量比為：馬鈴薯5-40%，葡萄糖1-5%，蛋白胨0.1-3%，余量為水，于0.1Mpa和121℃滅菌30min。采用恒溫搖床或各式發酵罐進行液體發酵，溫度設置23-30℃，發酵時間4-15天；
2)發酵產物處理：液體發酵結束后，除去菌絲體的發酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液經脫水、濃縮，得到有機粗提物浸膏；
3)所述的非蛋白質氨基酸前體的分離：將2)所述的有機粗提物浸膏用甲醇溶解，進行反相硅膠柱層析，用甲醇或丙酮濃度為10-50%的不同梯度甲醇或丙酮水為洗脫劑，將含有目標組分的洗脫液濃縮得到亞組分。用甲醇將亞組分溶解，進行凝膠柱層析，用丙酮或甲醇溶液洗脫，分管收集，將含有所述的非蛋白質氨基酸前體組分的洗脫液合并，接著進行正相硅膠柱層析，以氯仿裝柱，干法上樣，用含有甲醇體積比為1-10%的氯仿溶劑洗脫，得到含有所述的非蛋白質氨基酸前體組分。
4)所述的非蛋白質氨基酸的制備：將3)制備所得的非蛋白質氨基酸前體用酸或堿進行降解，再進行色譜分離純化得到所述的非蛋白質氨基酸。
5)所述的非蛋白質氨基酸在抗菌方面上的應用。
本專利技術制備的非蛋白質氨基酸對枯草芽孢桿菌有較好的抑制作用，可以利用菌株Paecilomycesgunnii發酵制得，培養基原料來源廣泛，制備方法簡單，容易實現工業化生產。
附圖說明
圖1所述化合物前體的化學結構。
圖2所述化合物前體的立體結構。
圖3所述化合物7-amino-4-hydroxyoct-2-enoicacid的化學結構。
圖4所述化合物的抗菌活性。其中1、2、3、4、5、6表示所述化合物的濃度分別為0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.025μg/uL；7、8、9、10分別表示甲醇（10μL/孔）、青霉素（0.02μg/uL）、賴氨酸（8μg/uL）、接10uL菌液的培養基；11為不接菌的培養基。
具體實施方式
以下實施例將對本專利技術作進一步說明。
實施例1將真菌古尼擬青霉(Paecilomycesgunnii）斜面菌種接種于裝有150mL馬鈴薯液體培養基的三角瓶中活化，活化條件為轉速230r/min，培養溫度28℃，培養時間6天，再進行大批量的液體發酵30L，采用培養基配方為：每升水中含馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，pH自然，0.1Mpa,121℃滅菌30min，置于28℃，230r/min恒溫搖床中培養。發酵11天后，用離心法將菌絲體與發酵液分離。發酵液用等體積的乙酸乙酯萃取，所得萃取物用無水硫酸鈉脫水，再用旋轉蒸發儀于40℃條件下真空濃縮，得到有機粗提物浸膏（6.34g）。
將上一步驟中得到的有機粗提物浸膏（6.34g），用甲醇溶解，進行反相硅（170g)柱層析，用30%甲醇水洗脫2L，流速為15mL/min，每管收集280mL，用旋轉蒸發儀真空濃縮后，分別取樣進行薄層層析分析合并（展開劑為氯仿：甲醇＝10：1，顯色劑為碘、10%硫酸乙醇或碘化鉍鉀），得到含有目標化合物前體的組分（852.3mg）。
從上一步驟得到的組分（852.3mg），用適量甲醇溶解，進行凝膠(120g，SephadexLH-20)柱層析，甲醇洗脫，流速約為12s/drop，每管收集4mL，根據薄層層析檢測合并得到含有目標化合物前體的組分(213.6mg)。
從上一步驟得到的組分(213.6mg)，用適量丙酮溶解，進行凝膠(120g，SephadexLH-20)柱層析，丙酮洗脫，流速約為12s/drop，每管收集4mL，根據薄層層析檢測合并得到目標化合物前體的組分(61mg)。
從上一步驟得到的組分(61mg)進行正相硅膠層析（5.2g硅膠），氯仿裝柱，干法上樣，流動相為氯仿：甲醇（60:1），洗脫體積為300mL，薄層層析檢測合并得到目標化合物前體（39.4mg）。
將上一步驟所得的化合物前體，進行核磁共振波譜（1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC、1H－1HCOSY和NOESY）、質譜（EI）、高分辨質譜（HREI－MS）、旋光（[α]）、紫外光譜（UV）、紅外光譜（IR）和X射線單晶衍射測定，并確定所述化合物前體結構（圖1）。
所述的化合物前體，白色，可溶于甲醇，[α]+19.7(c=0.07，MeOH)；UV-vis(MeOH)，λ/nm：207；HREIMS:406.2202（[M+]，C20H30N4O5;calc.406.2216)；IR(KBr)νmax：3428,2925,2855,1720，1384cm-1；其單晶熔點為197-200℃.結合1H和13CNMR譜數據(表1)確定化合物的分子式為C20H30N4O5。分析1H和13CNMR以及DEPT譜，表明所述的化合物前體含有3個甲基，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種具有抗菌活性的非蛋白質氨基酸，其特征在于：所述非蛋白質氨基酸為7?amino?4?hydroxyoct?2?enoic?acid，分子式為C8H15NO3，結構式如下：。

【技術特征摘要】
1.一種具有抗菌活性的非蛋白質氨基酸，其特征在于：所述非蛋白質氨基酸為7-amino-4-hydroxyoct-2-enoicacid，分子式為C8H15NO3，結構式如下：
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2.一種如權利要求1所述的非蛋白質氨基酸的制備方法，其特征在于：通過發酵培養古尼擬青霉Paecilomycesgunnii，獲取發酵物，然...

【專利技術屬性】
技術研發人員：鄭永標，許小萍，鄒先文，黃建忠，
申請(專利權)人：福建師范大學，
類型：發明
國別省市：福建;35