一種纖維素酶高產(chǎn)菌株及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種纖維素酶高產(chǎn)菌株及其應(yīng)用。首次揭示一株高產(chǎn)纖維素酶的里氏木霉菌株P(guān)PL3-1，其生產(chǎn)的纖維素酶在酶活和產(chǎn)量均具有顯著性的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明專利技術(shù)人還通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化提高了該菌株的纖維素酶產(chǎn)量。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及微生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本專利技術(shù)涉及一種纖維素酶高產(chǎn)菌株及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
纖維素是多個(gè)葡萄糖殘基以β-1,4-糖苷鍵連接而成的多聚物，是地球上最豐富的可再生的生物質(zhì)資源。以木質(zhì)纖維素為原料、用纖維素酶水解纖維素生成葡萄糖，進(jìn)而發(fā)酵為燃料乙醇成為應(yīng)對(duì)當(dāng)今世界能源危機(jī)、環(huán)境污染等問(wèn)題的重要出路。纖維素酶是指能夠?qū)⒗w維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖的一系列酶的總稱，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase，EC3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21)。內(nèi)切葡聚糖酶作用于纖維素長(zhǎng)鏈分子的內(nèi)部將長(zhǎng)纖維切成短纖維，外切葡聚糖酶作用于纖維素分子的一端，以兩個(gè)葡萄糖殘基為單位進(jìn)行切割生成纖維二糖，β-葡萄糖苷酶切割纖維二糖及一些纖維寡糖最終生成單個(gè)的葡萄糖分子。作為纖維素復(fù)合酶系的重要組成之一，β-葡萄糖苷酶的關(guān)鍵作用主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：一方面，由于纖維二糖積累對(duì)其上游內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活性具有顯著的反饋抑制作用，因此，β-葡萄糖苷酶對(duì)纖維二糖的高效水解能力對(duì)纖維素的徹底降解起到至關(guān)重要的作用。另一方面，除水解活性，β-葡萄糖苷酶還具有轉(zhuǎn)糖苷活性，在一定的條件下可以通過(guò)轉(zhuǎn)糖苷作用將兩個(gè)葡萄糖分子合成一個(gè)槐糖分子，而已經(jīng)發(fā)現(xiàn)槐糖是纖維素酶基因表達(dá)的強(qiáng)誘導(dǎo)物。一般認(rèn)為絲狀真菌中纖維素酶合成的誘導(dǎo)機(jī)制是：存在于分生孢子和菌絲表面的少量組成型纖維素酶首先降解纖維素生成纖維二糖等寡糖，然后在質(zhì)膜結(jié)合的葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷作用下，生成槐糖等誘導(dǎo)物，經(jīng)細(xì)胞膜上的組成型透性酶系統(tǒng)進(jìn)人細(xì)胞內(nèi)，啟動(dòng)纖維素酶的合成。由此可見(jiàn)，提高β-葡萄糖苷酶在纖維素降解體系的催化活性，對(duì)于提高纖維素降解體系轉(zhuǎn)化效率及降低纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)成本，具有巨大的商業(yè)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。纖維素酶種類繁多，許多微生物特別是真菌具有產(chǎn)生這種復(fù)合酶的能力，其中產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的有木霉、曲霉、根霉和青霉等，尤以木霉屬菌種居多。而里氏木霉(Trichodermareesei)則是纖維素酶工業(yè)中利用最多的菌株。里氏木霉菌株Qm6a為各個(gè)高產(chǎn)纖維素酶菌株的出發(fā)株，為了獲取高產(chǎn)纖維素酶的新菌株，Qm6a經(jīng)過(guò)兩輪直線加速器的誘變和篩選得到了更高效的產(chǎn)纖維素酶突變菌株Qm9414，但是仍然受到碳代謝阻遏，產(chǎn)酶狀況會(huì)隨著發(fā)酵時(shí)間增加，葡萄糖濃度升高，纖維素酶的合成逐漸受到抑制。為了獲得更高的纖維素酶產(chǎn)量，對(duì)Qm6a重新進(jìn)行育種，通過(guò)三輪誘變和篩選得到了抗碳代謝阻遏的高產(chǎn)菌株Rut-C30：第一輪通過(guò)紫外誘變和抗代謝阻遏篩選獲得了菌株M7；第二輪對(duì)M7通過(guò)N-硝基胍誘變得到突變株NG14，相比Qm9414，NG14胞外蛋白產(chǎn)量和濾紙酶活分別提高了1倍和4倍；第三輪在NG14的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)紫外誘變和抗代謝阻遏篩選的得到了更高效的產(chǎn)纖維素酶菌株Rut-C30。此外，在NG14的基礎(chǔ)上紫外誘變獲取了另一突變株RL-P37，另一工業(yè)上廣泛應(yīng)用的纖維素酶高產(chǎn)菌株CL-847是由Qm9414誘變而來(lái)。由于其高產(chǎn)纖維素酶的能力，在工業(yè)上被廣泛用于紡織、造紙、制漿及生物能源等領(lǐng)域。該菌目前最高發(fā)酵水平可達(dá)100g/L的蛋白產(chǎn)量，具有很強(qiáng)的蛋白分泌能力，同時(shí)對(duì)人畜安全，已經(jīng)被開(kāi)發(fā)成表達(dá)同源蛋白和異源蛋白的良好真菌宿主。在纖維素酶工業(yè)應(yīng)用中，里氏木霉的產(chǎn)酶和蛋白分泌能力的進(jìn)一步提高有助于纖維素酶應(yīng)用市場(chǎng)的進(jìn)一步打開(kāi)。但是，里氏木霉的高產(chǎn)菌株被歐美大公司所壟斷，限制了我國(guó)纖維素酶工業(yè)的發(fā)展。因此，有必要對(duì)里氏木霉進(jìn)行更加深入的改造，提高其產(chǎn)酶能力和蛋白分泌能力，降低纖維素酶的工業(yè)生產(chǎn)成本，進(jìn)而開(kāi)發(fā)有自主產(chǎn)權(quán)的工業(yè)菌株。由于里氏木霉的酶系組成中纖維素外切酶和內(nèi)切酶占了99％，而β-葡萄糖苷酶和其他纖維素酶和半纖維素酶則不到1％；同時(shí)真菌酶系大多數(shù)是偏酸性，而耐熱性也不佳，這些都成為了里氏木霉纖維素酶的瓶頸。雖然傳統(tǒng)的誘變育種可以獲得不少優(yōu)良的工業(yè)菌株，但Kubicek等認(rèn)為，從1978年到1991年單純通過(guò)傳統(tǒng)誘變方法獲得里氏木霉的突變株，在產(chǎn)酶能力上已經(jīng)沒(méi)有大的改觀。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，人們已經(jīng)逐漸從常規(guī)的誘變育種和改善發(fā)酵條件等傳統(tǒng)生物學(xué)轉(zhuǎn)向利用比較基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)，以此來(lái)分析了解一些高產(chǎn)菌株重要突變基因的功能和相關(guān)分子機(jī)制，并利用這些機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步遺傳改造以獲取更符合工業(yè)需求的生產(chǎn)菌株。尤其是2008年，里氏木霉Qm6a和Rut-C30的基因組測(cè)序完成并相繼公開(kāi)，Rut-C30高產(chǎn)的分子機(jī)制已經(jīng)用比較基因組的方法得到解析，如一系列轉(zhuǎn)錄因子、基礎(chǔ)代謝相關(guān)酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等基因的缺失。這些研究成果已經(jīng)被不少研究者應(yīng)用到工業(yè)菌種的改造中：特別是Rut-C30中最關(guān)鍵的cre1突變的發(fā)現(xiàn)，解釋了突變株的解阻遏現(xiàn)象。因此通過(guò)在野生型菌株敲除阻遏因子cre1或引入cre1突變，可顯著地提高重組菌株在葡萄糖及誘導(dǎo)條件下纖維素酶的表達(dá)；而Ace1是另一個(gè)產(chǎn)纖維素酶的抑制因子，在ace1敲除菌株中，在纖維素或槐糖誘導(dǎo)條件下主要的纖維素酶基因的表達(dá)都得到了上調(diào)。綜上，本領(lǐng)域有必要進(jìn)一步研究纖維素酶生產(chǎn)菌株，開(kāi)發(fā)性能優(yōu)良的菌株。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種纖維素酶高產(chǎn)菌株及其應(yīng)用。在本專利技術(shù)的第一方面，提供一種分離的里氏木霉菌株或其孢子、菌絲體、原生質(zhì)體，所述的菌株在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號(hào)為CCTCCNO:M2014561。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的保藏號(hào)為CCTCCNO:M2014561的里氏木霉菌株或其孢子生產(chǎn)的纖維素酶的酶活高于15IU/mL；較佳地高于20IU/mL。在另一優(yōu)選例中，保藏號(hào)為CCTCCNO:M2014561的菌株或其孢子、菌絲體、原生質(zhì)體中，轉(zhuǎn)化有潮霉素(hygromycin)抗性基因hph。在本專利技術(shù)的另一方面，提供一種里氏木霉菌株或其孢子、菌絲體、原生質(zhì)體，所述菌株是前面所述的里氏木霉菌株的培養(yǎng)后代，且其ura5基因發(fā)生缺失突變。較佳地，該后代菌株產(chǎn)生的纖維素酶的酶活高于25IU/mL。在本專利技術(shù)的另一方面，提供一種基因工程改造的里氏木霉菌株或其孢子、菌絲體、原生質(zhì)體，所述的菌株是在所述的里氏木霉菌株中轉(zhuǎn)化外源的ura5(較佳地，其來(lái)源于草酸青霉)和纖維素酶激活因子X(jué)yr1后獲得的菌株。在另一優(yōu)選例中，所述的ura5的核苷酸序列如SEQID本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種分離的里氏木霉菌株或其孢子、菌絲體、原生質(zhì)體，其特征在于，所述的菌株在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號(hào)為CCTCC?NO:M2014561。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種分離的里氏木霉菌株或其孢子、菌絲體、原生質(zhì)體，其特征在于，
所述的菌株在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號(hào)為CCTCCNO:M2014561。
2.一種里氏木霉菌株或其孢子、菌絲體、原生質(zhì)體，其特征在于，所述
菌株是權(quán)利要求1所述的里氏木霉菌株的培養(yǎng)后代，且其ura5基因發(fā)生缺失
突變。
3.一種基因工程改造的里氏木霉菌株或其孢子、菌絲體、原生質(zhì)體，其
特征在于，所述的菌株是轉(zhuǎn)化有外源的ura5和纖維素酶激活因子X(jué)yr1后獲得
的菌株的權(quán)利要求2所述的里氏木霉菌株。
4.如權(quán)利要求3所述的里氏木霉菌株或其孢子、菌絲體、原生質(zhì)體，其
特征在于，所述的ura5的核苷酸序列如SEQIDNO:5或6所示。
5.如權(quán)利要求4所述的里氏木霉菌株或其孢子、菌絲體、原生質(zhì)體，其
特征在于，所述的纖維素酶激活因子X(jué)yr1的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示。
6.一種里氏木霉菌株或其孢子、菌絲體、原生質(zhì)體，其特征在于，所述
菌株是過(guò)表達(dá)纖維素酶激活因子X(jué)yr1的權(quán)利要求1所述的里氏木霉菌株或其
孢子、菌絲體、原生質(zhì)體。
7.權(quán)利要求1-6任一所述的里氏木霉菌株或其孢子、菌絲體、原生質(zhì)體
的用途，其特征在于，用于生產(chǎn)纖維素酶；或用...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：周志華，鄒根，劉睿，陳玲，江艷萍，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：上海;31