檢測自身免疫性腎病的免疫印跡試劑盒及其制備方法技術

本發明專利技術涉及一種檢測自身免疫性腎病相關抗體的免疫印跡試劑盒及其制備方法，屬于生物醫學領域；包括：反應膜條、酶結合物、顯色底物、洗滌液、樣本稀釋液和終止液，所述的反應膜條由載體和固定在載體上的硝酸纖維素膜或尼龍膜所組成，在所述的硝酸纖維素膜或尼龍膜上含有：分別由C1q、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R和YHSD7A八種抗原中4～8種天然或重組抗原包被而成特定組合的平行的檢測線，1條高濃度為30~50μL/mL判斷指示帶，1條中濃度15~25μL/mL判斷指示帶，1條低濃度1~10μL/mL判斷指示帶；本發明專利技術克服單一自身抗體檢測靈敏度和特異性不足、數種疾病相關自身抗體逐一單獨檢測在操作上的繁瑣，大大提高檢測效率和結果判斷的準確度。

【技術實現步驟摘要】


本專利技術涉及一種檢測多種自身免疫性腎病相關抗體的免疫印跡試劑盒，還涉及該免疫印跡試劑盒的制備方法及使用方法，屬于生物醫學領域。

技術介紹

人體免疫系統的主要功能是識別和清除抗原性異物。正常情況下，機體對自身組織成分一般不會產生免疫應答，稱為免疫耐受。一旦這種耐受被打破，就會發生自身免疫性疾病。自身免疫性疾病突出表現為血清中多種自身抗體的形成及全身多臟器損傷，腎臟是最常見、最重要的受累器官之一。在各種自身免疫性腎病中，部分自身抗體既是某類疾病的標志性抗體，同時也可能是直接的致病性抗體，與病情活動及預后密切相關。
免疫性腎炎由各種病因引起的原發于腎臟的慢性腎小球疾病。又稱為原發性免疫性腎炎與繼發性者相區別。臨床上將由全身性疾病如糖尿病、系統性紅斑狼瘡、痛風等引起的繼發性慢性腎臟損害，按其原發病命名，如糖尿病腎病、狼瘡性腎炎等。由于這些病例的診斷和治療主要依據全身性疾病(如糖尿病等)，與原發性者有很大區別。在中國免疫性腎炎的發病率仍很高，1981年人群發生率為0.28～0.89%，是引起慢性腎功能衰竭的最重要病因之一（占60%）。不同病因引起的免疫性腎炎在癥狀上相似，治療上有共同之處，但預后從輕到重各不相同。本病主要是通過免疫性反應造成的腎損傷，不同的病因可以有相同的腎損害。臨床表現有不同程度的蛋白尿、血尿、管型尿、水腫、高血壓及不同程度的腎功能損害。起病可急可緩，但多數病例不是從急性腎炎演變而來。因此，對免疫性腎炎的理解，應為潛在病理改變的持續性或進行性發展，使病情遷延，成為慢性，而不單純是急性腎炎的慢性階段。早期診斷有助于自身免疫性疾病的臨床控制。
許多自身抗體在相關疾病的發病前一段時間就可從血清中檢測到。幾十年來，免疫學研究已發現多數自身免疫性腎病患者血清中存在著特異性自身抗體，例如狼瘡性腎炎（LN）的抗C1q抗體、抗核小體（Nucleosome）抗體和抗雙鏈DNA（dsDNA）抗體，原發性壞死性新月體性腎小球腎炎（NCGN）的抗髓過氧化物酶（MPO）抗體，由韋格拉肉芽腫病（WG）誘發腎炎的抗蛋白酶3抗體（PR3），抗腎小球基底膜型腎小球腎炎的抗腎小球基底膜抗體（GBM），膜性腎病（MN）的抗磷脂酶A2受體（PLA2R）抗體和成人特發性膜性腎病的1型血小板反應蛋白7A（THSD7A）抗體，許多特異性自身抗體是自身免疫性腎病診斷標準中重要的組成部分。
C1q分子分為頭狀區和膠原區：頭狀區可與IgG的CH2結構域結合；膠原樣區有6個結合C1r和C1s的位點。
抗C1q抗體與狼瘡性腎炎的發生、發展密切相關，并可以預測狼瘡性腎炎病情的復發，動物實驗表明，C1q和抗C1q抗體組成的免疫復合物可以沉積在腎臟，并引起補體激活、白細胞浸潤、炎癥損傷和蛋白尿；體外實驗表明活動性狼瘡腎炎患者血清患者的血清引起正常人淋巴細胞凋亡明顯高于非活性狼瘡腎炎患者和正常人，且凋亡的細胞比例與抗C1q抗體滴度密切相關。在狼瘡腎（lupusnephritis，IN）患者中，存在著抗C1q抗體的高表達，抗C1q抗體在lN疾病中起較為重要作用。抗C1q抗體是反映系統性紅斑狼瘡（systemlupuserythematosus，SLE）患者并發腎臟損傷的重要指標，在IN診斷和判定其活動性方面有重要作用，與SLE的發生發展密切相關，能較好的反映SLE病情的活動性
核小體是染色質的基本單位，每個核小體由組蛋白八聚體和DNA構成。凋亡細胞是核小體的重要來源，SLE中細胞凋亡增多，導致核小體的過渡釋放。由于核小體與其他狼瘡自身抗原聚集在凋亡小體內，由此推測SLE循環中持續存在的凋亡細胞觸發了自身抗體的產生。相同個體中抗組蛋白抗體與抗dsDNA抗體伴隨出現，說明這兩種自身抗體有相同的靶抗原，即由dsDNA和組蛋白構成的核小體誘導產生。狼瘡病血清特異性的研究證明核小體是狼瘡抗dsDNA抗體和抗組蛋白抗體的首要專一的靶抗原。
抗核小體抗體家族在臨床上只出現于SLE、硬皮病和混合性結締組織病。高水平的抗核小體IgG抗體幾乎是僅在SLE中出現。目前臨床實驗室診斷SLE的標志性抗體為抗dsDNA抗體，這兩種抗體診斷SLE的特異性高，但敏感性差，SLE患者中抗dsDNA抗體陽性率為30%～90%，特異性為90%；抗核小體抗體陽性率為58%～66%，特異性為98%。
抗dsDNA是SLE患者的特征性抗體，抗體的滴度與疾病的活動程度有相關性。抗核小體抗體可出現在SLE活動期或非活動期，抗dsDNA抗體陰性的SLE患者抗核小體抗體是一個敏感的指標。抗核小體抗體效價與疾病活動性有密切關系，在SLE的診斷和疾病監測中有重要意義。
抗蛋白酶3（PR3）抗體屬于抗中性粒細胞胞漿抗體（ANCA）中的一種，是cANCA的主要靶抗原，在間接免疫熒光法檢測用乙醇固定的中性粒細胞呈cANCA熒光模式，ANCA是鑒別診斷血管炎的重要標記物。抗PR3抗體是韋格拉肉芽腫病（WG）的特異性抗體。盡管其發病機制不清，但是抗PR3抗體與韋格拉肉芽腫病發病機制具有一定的相關性。
cANCA診斷WG的特異性為90%，活動性WG患者在病變尚未影響到呼吸系統時cANCA敏感性是65%，當患者出現呼吸系統、腎臟損害時其靈敏度達90%以上。
髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）又稱過氧化物酶，是一種重要的含鐵溶酶體，存在于髓系細胞(主要是中性粒細胞和單核細胞)的嗜苯胺藍顆粒中，是髓細胞的特異性標志，隨著對MPO研究的深入，人們發現MPO基因多態性導致個體對一些疾病易感性的差異，與人類多種疾病的發生、發展密切相關，因此越來越受到國內外學者的重視。
抗髓過氧化酶抗體（myeloperoxidase~antineutrophilcy~toplasmicantibody，MPO~ANCA）是抗中性粒細胞胞漿抗體（ANCA）相關性血管炎（antineutrophilcytopasmicantibodyassociatedvasculitis，AAV）的主要自身抗體之一，是我國AAV患者血清中的最主要自身抗體。臨床研究報道，MPO~ANCA陽性母親可通過胎盤傳遞自身抗體，導致新生兒出現MPO~ANCA相關性血管炎（MPO~ANCAassociatedvasculitis，MPO~AAV）的臨床表現腎小球腎炎和肺出血。
抗MPO抗體主要見于原發性壞死性新月體性腎小球腎炎（NCGN）、顯微鏡下多動脈炎（MPA）和變應性肉芽腫血管炎（CSS），還見于結節性多動脈炎（PAN）、系統性紅斑狼瘡（SLE）、類風濕性關節炎（RA）、干燥綜合性（SS）和系統性硬化病（SSc）等疾病。MPO~ANCA抗體的濃度與病情的活動性相關，可用于早期診斷、判斷療效、估計復發和指導臨床治療。
腎小球基底膜是由腎小球毛細血管內外透明層及中間致密層構成的網狀結構，以糖蛋白為主體。抗GBM抗體就是血清中會“攻擊”基底膜的一種抗體。
抗腎小球基底膜（GBM）抗體相關疾病是一組自身免疫性疾病，該病的致病因素為血清存在抗GBM抗體。由于肺和腎小球的基底膜具有共同的抗原，因此主要的受累臟器是肺和腎臟。腎臟受累多為新月體性腎炎，腎功能損害進展迅速，少數為輕度系膜增生性腎炎，可保持腎功能正常。\本文檔來自技高網...

【技術保護點】
檢測自身免疫性腎病抗體的免疫印跡試劑盒，包括：反應膜條、酶結合物、顯色底物、洗滌液、樣本稀釋液和終止液，其特征在于：所述的反應膜條由載體和固定在載體上的硝酸纖維素膜或尼龍膜所組成，在所述的硝酸纖維素膜或尼龍膜上含有：分別由C1q、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R和YHSD7A八種抗原中4～8種天然或重組抗原包被而成特定組合的平行的檢測線，1條高濃度為30~50?μL/mL判斷指示帶，1條中濃度15~25?μL/mL判斷指示帶，1條低濃度1~10?μL/mL判斷指示帶。

【技術特征摘要】
1.檢測自身免疫性腎病抗體的免疫印跡試劑盒，包括：反應膜條、酶結合物、顯色底物、洗滌液、樣本稀釋液和終止液，其特征在于：所述的反應膜條由載體和固定在載體上的硝酸纖維素膜或尼龍膜所組成，在所述的硝酸纖維素膜或尼龍膜上含有：分別由C1q、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R和YHSD7A八種抗原中4～8種天然或重組抗原包被而成特定組合的平行的檢測線，1條高濃度為30~50μL/mL判斷指示帶，1條中濃度15~25μL/mL判斷指示帶，1條低濃度1~10μL/mL判斷指示帶。
2.根據專利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的載體為雙面粘性的PVC板，正面與所述的硝酸纖維素膜或尼龍膜固定粘接，背面固定粘接有透明的PET底襯板。
3.根據專利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的高濃度判斷指示帶、中濃度判斷指示帶、低濃度判斷指示帶由人IgG，或抗鼠IgG或羊IgG劃線而成。
4.根據專利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的酶免結合物為辣根過氧化酶標記的鼠抗人IgG；所述的顯色底物為四甲基聯苯胺；所述的洗滌液為20×Tris緩沖液；所述樣本稀釋液為含封閉劑的Tris緩沖液；所述的終止液為0.1M/L硫酸。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：在同一硝酸纖維素膜或尼龍膜上，同時包被C1q、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R和YHSD7A八種抗原中的至少4天然或重組抗原，分別包被形成的4～8條平行的檢測線，可同時、快捷的、準確的對狼瘡性腎炎（LN），原發性壞死性新月體性腎小球腎炎（NCGN），抗腎小球基底膜型腎小球腎炎，膜性腎病（MN）和成人特發性膜性腎病等多種腎病進行檢測篩查。
6.權利要求1～5任一項所述試劑盒的制備方法，包括有反應膜條制備方法有兩種，包括貼膜法和劃線法，其特征在于所述反應膜條制備...

【專利技術屬性】
技術研發人員：何林，胡鹍輝，劉清波，陽輝，
申請(專利權)人：深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44