一種嘌呤霉素衍生物及其制備與應用制造技術

本發明專利技術公開了一種式(Ⅰ)所示嘌呤霉素衍生物及其制備與應用，本發明專利技術首次通過工程化生物合成的方法生產出一種新型的能夠抑制革蘭氏陽性細菌的化合物12?去甲基?dutomycin；12?去甲基?dutomycin對革蘭氏陽性細菌的抑菌活性顯著高于其來源的天然化合物dutomycin；本發明專利技術的利用生物合成方法生產抑制革蘭氏陽性細菌的化合物12?去甲基?dutomycin的方法及其提取工藝產物產量最高可達44mg/L，不受原料來源限制，操作過程易控制，生產成本低。

【技術實現步驟摘要】
一種嘌呤霉素衍生物及其制備與應用(一)
本專利技術涉及一種革蘭氏陽性細菌抑制劑，特別涉及一種嘌呤霉素衍生物及其制備與應用。(二)
技術介紹
傳染性疾病是世界上導致人類死亡的主要原因之一。在細菌傳染性疾病治療中抗生素扮演著重要角色并且已經拯救了數百萬人的生命。自從1928年發現了世界上第一種抗生素——青霉素以來，大量具有抗菌活性的天然化合物被分離出來并用作抗傳染性藥物，例如四環素和卡那霉素。但是抗生素的過度使用也導致了微生物產生抗藥性。例如一種革蘭氏陽性細菌，即耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)被看作是“超級”細菌，因為它對包括甲氧西林在內的治療具有抗性。這些耐藥病原菌的傳播對人類健康構成了巨大的威脅。因此我們目前迫切需要發現一種新的，可以有效抑制MRSA和其它革蘭氏陽性病原細菌的抗生素。天然產物是新藥的一種重要來源，包括四環素、青霉素、萬古霉素在內的很多應用于臨床的抗生素都是天然產物。放線菌是很多抗生素的主要生產菌，如鏈霉菌MK277-AF1合成的天然化合物polyketomycin以及本專利技術中美濃鏈霉菌合成的天然化合物dutomycin均被證明具有顯著的革蘭氏陽性細菌抗菌活性。從自然界中不斷尋找新的抗菌分子是推動新抗生素發展的關鍵，但通過傳統方法發現的新抗生素活性有限，且這些方法通常耗時耗力，同時需要大量的天然產物資源用于抗菌活性化合物的篩選，而近年來興起的工程化生物合成的方法可以節省抗生素發現過程中的時間和資源，并且代表了一個有吸引力的方法來創造多樣性的抗菌活性分子化合物庫，以從中篩選抗菌活性更好的“非天然的”天然產物。(三)
技術實現思路
本專利技術目的是通過工程化生物合成的手段生產一種天然抗菌活性化合物嘌呤霉素(dutomycin)衍生物，其革蘭氏陽性細菌的抗菌活性顯著高于dutomycin，提取產物產率高，不受原料來源限制，操作過程易控制。本專利技術采用的技術方案是：本專利技術提供一種式(Ⅰ)所示嘌呤霉素衍生物(即12-去甲基-dutomycin)，所述嘌呤霉素(dutomycin)如式(Ⅱ)所示：本專利技術還提供一種所述嘌呤霉素衍生物的制備方法，所述方法為：將美濃鏈霉菌重組菌株接種在YM培養基中，在30℃、250rpm下培養3-7天，培養物分離純化，獲得所述嘌呤霉素衍生物；所述美濃鏈霉菌重組菌株是將美濃鏈霉菌的甲基轉移酶DutMT1基因敲除構建而成；所述YM培養基質量終濃度組成為：酪蛋白胨0.5％、麥芽浸粉0.3％、葡萄糖1％、酵母浸粉0.3％，50μg/mL安普霉素，溶劑為去離子水，pH6.2。進一步，優選所述美濃鏈霉菌重組菌株是將美濃鏈霉菌(Streptomycesminoensis)ATCC19787的甲基轉移酶DutMT1基因敲除構建而成，具體構建方法為：以美濃鏈霉菌ATCC19787基因組DNA為模板，使用引物DutMT1-F:5'-AAAAGCTTCCTGCGCGACATGGTCCTGT-3'和引物DutMT1-R:5'-AATCTAGACGACCAGGTTCTCGATCACG-3'通過聚合酶鏈式反應擴增用于基因敲除實驗的長度為0.6kb左右的基因組DNA片段，通過限制性核酸內切酶HindIII和XbaI將上述擴增反應得到的DNA片段連接到大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體pKC1139中，即得本專利技術所需的甲基轉移酶DutMT1基因敲除質粒pSW91；將基因敲除質粒pSW91通過氯化鈣介導的化學轉化方法導入大腸桿菌pUZ8002中，再通過接合作用將基因敲除質粒pSW91轉移到美濃鏈霉菌野生型菌株中，將包含基因敲除質粒pSW91的美濃鏈霉菌接種在MS固體培養基上，在28℃培養20天，再挑取菌落到3mLTSB培養基中，在28℃培養5天，然后取50μL培養液涂布到ISP4固體培養基上，在37℃培養5天，獲得敲除了甲基轉移酶DutMT1的美濃鏈霉菌重組菌株。進一步，所述培養物分離純化方法為：培養結束后，將培養物用等體積的乙酸乙酯萃取(優選萃取3次，合并萃取液)，萃取液干燥去除乙酸乙酯，再用甲醇溶解后，在60目的硅膠柱上用體積比為100:0、75:25、50:50、25:75、0:100的氯仿-甲醇溶液進行洗脫，通過液相色譜檢測流出液，收集體積比75:25氯仿-甲醇溶液的流出液，再將所述流出液利用液相色譜分離，用流速為1mL/min的乙腈-水混合液梯度洗脫，在20分鐘內，乙腈-水的體積比由70:30逐漸提高到75:25，收集目標流出液，獲得所述嘌呤霉素衍生物。進一步，所述萃取液在40℃下真空干燥至恒重。進一步，所述收集目標流出液是在保持乙腈-水的體積比為75:25再洗脫10分鐘，收集在26.5-27.2分鐘的流出液。本專利技術還提供一種所述嘌呤霉素衍生物在制備革蘭氏陽性細菌活性抑制劑中的應用，所述嘌呤霉素衍生物對革蘭氏陽性細菌的最小抑菌濃度為0.125μg/mL。與現有技術相比，本專利技術有益效果主要體現在：(1)首次通過工程化生物合成的方法生產出一種新型的能夠抑制革蘭氏陽性細菌的化合物12-去甲基-dutomycin；(2)生物合成的化合物12-去甲基-dutomycin對革蘭氏陽性細菌的抑菌活性顯著高于其來源的天然化合物dutomycin；(3)本專利技術的利用生物合成方法生產抑制革蘭氏陽性細菌的化合物12-去甲基-dutomycin的方法及其提取工藝產物產量最高可達44mg/L，不受原料來源限制，操作過程易控制，生產成本低。(四)附圖說明圖1：美濃鏈霉菌重組菌株中甲基轉移酶DutMT1基因敲除的PCR驗證結果；1為以美濃鏈霉菌野生型菌株基因組DNA為模板，用引物M13-47與DutMT1-Check1進行PCR擴增的結果；2為以美濃鏈霉菌野生型菌株基因組DNA為模板，用引物RM-V與DutMT1-Check2進行PCR擴增的結果；3為以美濃鏈霉菌重組菌株基因組DNA為模板，用引物M13-47與DutMT1-Check1進行PCR擴增的結果；4為以美濃鏈霉菌重組菌株基因組DNA為模板，用引物RM-V與DutMT1-Check2進行PCR擴增的結果；5為DNA分子量標準。圖2液相色譜純化目標化合物過程的檢測結果，(i)來源于實施例1美濃鏈霉菌野生型菌株的培養液；(ii)來源于實施例1甲基轉移酶DutMT1基因被敲除的美濃鏈霉菌重組菌株的培養液；(iii)來源于實施例6甲基轉移酶DutMT2基因被敲除的美濃鏈霉菌重組菌株的培養液；(iv)來源于實施例7糖基轉移酶DutGT2基因被敲除的美濃鏈霉菌重組菌株的培養液。圖3dutomycin與12-去甲基-dutomycin的質譜檢測圖。(五)具體實施方式下面結合具體實施例對本專利技術進行進一步描述，但本專利技術的保護范圍并不僅限于此：實施例1(1)甲基轉移酶DutMT1基因敲除質粒的構建用植物基因組DNA提取試劑盒純化菌株編號為ATCC19787的美濃鏈霉菌(Streptomycesminoensis)野生型菌株的基因組DNA；以純化的美濃鏈霉菌野生型菌株基因組DNA作為模板，使用引物DutMT1-F:5'-AAAAGCTTCCTGCGCGACATGGTCCTGT-3'和引物DutMT1-R:5'-AATCTAGACGACCAGGTTCTCGATCACG-3'通過聚合酶鏈式反應擴本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種式(Ⅰ)所示嘌呤霉素衍生物，

【技術特征摘要】
1.一種式(Ⅰ)所示嘌呤霉素衍生物，2.一種權利要求1所述嘌呤霉素衍生物的制備方法，其特征在于所述方法為：將美濃鏈霉菌重組菌株接種在YM培養基中，在30℃、250rpm下培養3-7天，培養結束后，將培養物用等體積的乙酸乙酯萃取，萃取液干燥去除乙酸乙酯，再用甲醇溶解后，在60目的硅膠柱上用體積比為100:0、75:25、50:50、25:75、0:100的氯仿-甲醇溶液進行洗脫，通過液相色譜檢測流出液，收集體積比75:25氯仿-甲醇溶液的流出液，再將所述流出液利用液相色譜分離，用流速為1mL/min的乙腈-水混合液梯度洗脫，在20分鐘內，乙腈-水的體積比由70:30逐漸提高到75:25，收集目標流出液，獲得所述嘌呤霉素衍生物；所述美濃鏈霉菌重組菌株是將美濃鏈霉菌Streptomycesmin...

【專利技術屬性】
技術研發人員：占紀勛，于大禹，
申請(專利權)人：杭州唯鉑萊生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：浙江;33