一種用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞傳代過程中Nanog基因表達(dá)量的引物及檢測(cè)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞體外傳代過程中Nanog基因表達(dá)量的引物，包括Nanog?F?ATGCCTGGTGAACCCGAC和Nanog?R?AGGACTGGATGTTCTGGGT，以及β?actin?F?CACGAAACTACCTTCAACTCC和β?actin?R?CATACTCCTGCTTGCTGATC。檢測(cè)方法包括以下步驟：(1)提取間充質(zhì)干細(xì)胞，并傳代培養(yǎng)；(2)提取各代次間充質(zhì)干細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行RT?PCR擴(kuò)增；(3)使用所述引物對(duì)擴(kuò)增基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。該引物特異性好、準(zhǔn)確性高、靈敏度高，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，可檢測(cè)出基因表達(dá)量的微小變化。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物
，具體涉及一種用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞傳代過程中Nanog基因表達(dá)量的引物及檢測(cè)方法。
技術(shù)介紹
2003年，Chambers等和Mitsui等幾乎同時(shí)報(bào)道了一種在囊胚內(nèi)細(xì)胞群(inner cell mass，ICM)、原始生殖細(xì)胞以及胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)表達(dá)的新轉(zhuǎn)錄因子，命名為Nanog。Nanog基因?qū)儆贏NTP類，NK家族基因，在人定位于12號(hào)染色體12p13～31，其cDNA由2184個(gè)核苷酸租成，包涵1個(gè)開放閱讀框，編碼305個(gè)氨基酸組成的多肽。Nanog基因的發(fā)現(xiàn)是在研究維持ESCs亞全能性和胚胎發(fā)育的相關(guān)基因方面取得的最大進(jìn)展，除了有助于ESCs自我更新和維持其未分化狀態(tài)，還能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。去除Nanog基因?qū)?huì)導(dǎo)致ESCs向原始內(nèi)胚層樣細(xì)胞的分化，說明Nanog是組織ESCs分化為原始內(nèi)胚層的關(guān)鍵因子。有研究認(rèn)為Nanog基因也是“逆轉(zhuǎn)因”(reversine)物質(zhì)，可以把普通細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕咛ゼ?xì)胞，再指導(dǎo)新細(xì)胞生長(zhǎng)出人類需要的各種人體組織，來(lái)代替已失去功能的組織器官，這也是再生醫(yī)學(xué)時(shí)代到來(lái)的原因之一。也有人應(yīng)用Northern Blot和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)小鼠腎臟中Nanog基因的曾齡變化，發(fā)現(xiàn)腎乳頭區(qū)細(xì)胞表達(dá)較高，并且有年齡依賴性行為。Izadpanah等在研究成年恒河猴間充質(zhì)干細(xì)胞是否具有多項(xiàng)分化潛能時(shí)，發(fā)現(xiàn)有Nanog的表達(dá)。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)在睪丸原位癌和睪丸原位癌來(lái)源的睪丸腫瘤中有大量Nanog表達(dá)，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在正常睪丸中沒有檢測(cè)到該基因蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。這說明Nanog可能是某些腫瘤標(biāo)志之一，并在一定程度上解釋了這些 腫瘤細(xì)胞可以無(wú)休止增殖的原因。因此，通過檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞中Nanog基因的表達(dá)變化對(duì)再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用、細(xì)胞治療和基因治療領(lǐng)域都具有重要意義。本領(lǐng)域迫切需要特異性好、靈敏都高的檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞體外傳代過程中Nanog基因表達(dá)量變化的方法。而在很多基因表達(dá)量研究中，大多采用Northern印跡法或者RT-PCR后進(jìn)行電泳的方法來(lái)檢測(cè)基因的表達(dá)量，但是Northern印跡法檢測(cè)效率不高，靈敏度也低，無(wú)法檢出微小的基因表達(dá)量變化，RT-PCR電泳的方法由于產(chǎn)物量因?yàn)槊阁w系的影響而產(chǎn)生的波動(dòng)在呈指數(shù)增長(zhǎng)的PCR中會(huì)被轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物量間很大的差異，所以準(zhǔn)確性不是很好。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本專利技術(shù)提供一種用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞傳代過程中Nanog基因表達(dá)量的引物及檢測(cè)方法，可有效解決現(xiàn)有技術(shù)中的檢測(cè)效率不高、靈敏度較低、準(zhǔn)確性不好的問題。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞體外傳代過程中Nanog基因表達(dá)量的引物，包括Nanog基因的上游引物5'-ATGCCTGGTGAACCCGAC-3'和下游引物5'-AGGACTGGATGTTCTGGGT-3'，以及β-actin內(nèi)參基因的上游引物5'-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3'和下游引物5'-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3'。使用上述引物檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞體外傳代過程中Nanog基因表達(dá)量的方法，包括以下步驟：(1)提取間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)；(2)提取各代次間充質(zhì)干細(xì)胞的總RNA，然后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；(3)使用上述引物對(duì)擴(kuò)增基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，確定Nanog 基因表達(dá)量。進(jìn)一步地，RT-PCR反應(yīng)體系為：Total RNA 0.1 ng-5μg、濃度為100μM的Oligo dT引物1μL，補(bǔ)充水至12μL，然后再添加5×Reaction Buffer 4μL、20U/μL的RiboLock RNase inhibitor 1μL、10mM dNTP MIX 2μL和200U/μL的RevertAid M-Mul V RT 1μL。進(jìn)一步地，RT-PCR擴(kuò)增條件為：42℃ 60min，然后70℃ 5min。進(jìn)一步地，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為：Fast SYBR Green Master mix 10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、cDNA 2μL，然后添加水至20μL。進(jìn)一步地，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性15s，60℃退火60s，共39個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸1min。進(jìn)一步地，間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。本專利技術(shù)提供的一種用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞傳代過程中Nanog基因表達(dá)量的引物及檢測(cè)方法，具有以下有益效果：(1)本專利技術(shù)提供了用于檢測(cè)Nanog基因表達(dá)量的引物以及管家基因β-actin的引物，引物特異性好，準(zhǔn)確性好，實(shí)現(xiàn)了Nanog基因表達(dá)量的檢測(cè)，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。(2)本專利技術(shù)還提供了一種間充質(zhì)干細(xì)胞傳代過程中Nanog基因表達(dá)量的檢測(cè)方法，采用此方法，具有特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，可以為間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志基因研究、腫瘤標(biāo)志基因的研究及再生醫(yī)學(xué)中間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用提供幫助。附圖說明圖1為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞P1、P3、P5、P7和P10代中Nanog基因的實(shí)時(shí) 熒光定量PCR擴(kuò)增圖；圖2為胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞P7代中Nanog基因的溶解曲線；圖3為胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞P1、P3、P5、P7和P10代中Nanog基因的溶解曲線；圖4為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞傳代過程中Nanog基因表達(dá)量的計(jì)算結(jié)果圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種間充質(zhì)干細(xì)胞體外傳代過程中Nanog基因表達(dá)量的檢測(cè)方法，包括以下步驟：(1)提取間充質(zhì)干細(xì)胞UC-MSCs：在生物安全柜中將臍帶用生理鹽水沖洗干凈后，剝離羊膜上皮，去除臍動(dòng)脈和臍靜脈，然后將臍帶膠質(zhì)剪碎后加入30mL Ⅱ型膠原酶，置于37℃，200r/min下持續(xù)消化6h，100目篩網(wǎng)過濾收集細(xì)胞，然后于1200r/min離心10min，棄上清，用D-Hank’s液輕柔沖洗細(xì)胞3次，無(wú)血清培養(yǎng)基(hyclone公司)重懸細(xì)胞，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6-7d后全量換液，棄掉未貼壁細(xì)胞，根據(jù)粘附性差異使UC-MSCs與其他組織細(xì)胞分離，分離后細(xì)胞經(jīng)過表面標(biāo)志物鑒定，從而確定為UC-MSCs，然后使用胰蛋白酶將其消化后，在細(xì)胞瓶?jī)?nèi)接種1×106個(gè)細(xì)胞，添加20mL無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3-4d換液1次進(jìn)行傳代培養(yǎng)；AD-MSCs：取成人吸脂術(shù)后的脂肪組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)浸泡沖洗3次去除血液，加入等體積0.1％I型膠原酶，于37℃水浴震蕩消化1h，低糖DMEM(Gibco)終止消化，2000r/min離心5min，棄上清，再用低糖DMEM 重懸沉淀，200目濾網(wǎng)過濾，向沉淀中再加入3mL低糖DMEM，吹打均勻后移入培養(yǎng)瓶，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，首次換液，去除殘余的紅細(xì)胞及未貼壁細(xì)胞，根據(jù)黏附性差異使AD-MSCs與其他組織細(xì)胞分離，分離后細(xì)胞經(jīng)過表面標(biāo)志物鑒定，從而確定為AD-MSCs，然后使用胰蛋白酶將其消化后，在細(xì)胞瓶?jī)?nèi)接種1×106細(xì)胞，添加20mL無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng),以后每隔3～4d換液1次進(jìn)行傳代培養(yǎng)；PMSCs本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞體外傳代過程中Nanog基因表達(dá)量的引物，其特征在于，包括Nanog基因的上游引物5'?ATGCCTGGTGAACCCGAC?3'和下游引物5'?AGGACTGGATGTTCTGGGT?3'，以及β?actin內(nèi)參基因的上游引物5'?CACGAAACTACCTTCAACTCC?3'和下游引物5'?CATACTCCTGCTTGCTGATC?3'。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞體外傳代過程中Nanog基因表達(dá)量的引物，其特征在于，包括Nanog基因的上游引物5'-ATGCCTGGTGAACCCGAC-3'和下游引物5'-AGGACTGGATGTTCTGGGT-3'，以及β-actin內(nèi)參基因的上游引物5'-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3'和下游引物5'-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3'。2.一種間充質(zhì)干細(xì)胞體外傳代過程中Nanog基因表達(dá)量的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)提取間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)；(2)提取各代次間充質(zhì)干細(xì)胞的總RNA，然后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；(3)使用所述引物對(duì)擴(kuò)增基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，確定Nanog基因表達(dá)量。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的間充質(zhì)干細(xì)胞體外傳代過程中Nanog基因表達(dá)量的檢測(cè)方法，其特征在于，RT-PCR反應(yīng)體系為：Total RNA 0.1ng-5μg、濃度為100μM的Oligo dT引物1μL，補(bǔ)充水至12μL，然后再添加5×Reaction Buffer 4μL、20U/μL的RiboLock RN...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉宇，張蓉，馬明，李曉瑞，林秀芳，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：成都中創(chuàng)清科醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：四川;51