本發明專利技術提供了一種保藏號為CGMCCNo.11750的枯草芽孢桿菌(Busillus?subtilis)，以及含有此枯草芽孢桿菌的微生物菌劑，還提供了所述枯草芽孢桿菌或微生物菌劑在防治番茄、黃瓜、草莓等果蔬灰霉病中的應用，本發明專利技術提供的保藏號為CGMCCNo.11750的枯草芽孢桿菌及含有該菌的微生物菌劑對灰霉病菌有很強的拮抗作用，且見效快，防效持續時間長。利用本發明專利技術篩選出的枯草芽孢桿菌菌株可以制成相應的微生物制劑，將制得的微生物菌劑施用到田間后，通過該枯草芽孢桿菌的作用能夠防治番茄、黃瓜、草莓等蔬菜灰霉病的發生，從而降低果蔬生產過程中化學農藥的施用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物
，具體涉及一種枯草芽孢桿菌J-5及其生物菌劑和應用。
技術介紹
灰霉菌（Botrytis cinerea），又稱灰葡萄孢菌，是一類世界性分布的真菌，它是一種廣寄主性的、能夠引起200多種已知植物（如水果、蔬菜及花卉）灰霉病的壞死營養型病原真菌。以菌核、分生孢子及菌絲體隨病殘組織在土壤中越冬，通過傷口、自然孔口及幼嫩組織侵入寄主，發病后又可產生大量分生孢子，借風雨傳播蔓延進行多次再侵染，引起灰霉病，花、果、葉、莖均可發病，造成作物萎蔫死亡，影響產量和品質，是生產上防治最艱難的重要病害之一。在黃瓜、番茄、茄、甜椒、草莓等上，灰霉病病苗色淺，葉片、葉柄發病呈灰白色，水漬狀，組織軟化至腐爛，高濕時表面生有灰霉。幼莖多在葉柄基部初生不規則水浸斑，很快變軟腐爛，縊縮或折倒，最后病苗腐爛枯萎病死。果實染病，青果受害重，殘留的柱頭或花瓣多先被侵染，后向果實擴展，致使果皮呈灰白色，并生有厚厚的灰色霉層，呈水腐狀，葉片發病從葉尖開始，沿葉脈間成“V”形向內擴展，灰褐色，邊有深淺相間的紋狀線，病鍵交界分明。染病地塊輕則減產20%，嚴重的減產50%以上。目前灰霉病已成為黃瓜、番茄、茄、甜椒、草莓生產上的一種主要病害，對黃瓜、番茄、茄、甜椒、草莓產量和品質構成了極為嚴重的威脅，該病目前主要通過殺菌劑類化學農藥進行防治，但是效果不佳且對環境污染較為嚴重，急需尋找低污染、高防效的灰霉病防治方式。利用拮抗微生物防治農作物病害由于具有低污染、低殘留、不引起病害抗性等優點，近年來得到廣泛的重視。該防治方式的關鍵是篩選出對病原微生物有拮抗作用且抑菌譜廣的拮抗微生物，并利用菌劑或者其代謝產物粗提取物形成生物制劑，在黃瓜、番茄、茄、甜椒、草莓的灰霉病防治上進行應用。目前已有一些用于灰霉病生物防治的生防制劑，但大多抑菌效果不夠理想，抑菌譜窄，且作用持續時間短。因此，迫切需要篩選出一種能夠高效、持久拮抗灰霉病病源菌的微生物菌株及相關的微生物菌劑，從而通過生物防治降低灰霉病給黃瓜、番茄、茄、甜椒、草莓生產帶來的危害。
技術實現思路
基于以上技術現狀，本專利技術的目的在于提供一種能夠有效、持久抑制灰霉菌生長，尤其是能夠高效拮抗黃瓜、番茄、茄、甜椒、草莓灰霉病的枯草芽孢桿菌菌株，并且本專利技術還提供了一種含有上述枯草芽孢桿菌菌株的用于防治灰霉菌感染所致的黃瓜、番茄、茄、甜椒、草莓灰霉病的生物菌劑。為了達到上述專利技術目的，本專利技術所采用的技術方案如下：本專利技術所述的枯草芽孢桿菌J-5于2015年11月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心進行了保藏，保藏號為：CGMCC No. 11750。本專利技術還提供了含有所述枯草芽孢桿菌J-5的生物菌劑，其中枯草芽孢桿菌J-5的含量為4×109cfu/g~7×109cfu/g菌劑。所述生物菌劑為枯草芽孢桿菌J-5的芽孢菌劑的混合菌劑。本專利技術還提供了所述枯草芽孢桿菌J-5及其菌劑在防治黃瓜、番茄、茄、甜椒、草莓等果蔬灰霉病中的應用。本專利技術的有益效果為：本專利技術的枯草芽孢桿菌J-5可以有效抑制灰霉菌感染所致的黃瓜、番茄、茄、甜椒、草莓灰霉病，具有高效的防治作用，有效率可以達到60%以上，且見效快，作用持續時間長。作為生物介入手段，可以避免化學品如農藥引起的殘留和污染，是一種更經濟、環保、綠色的植物病害防治手段。本專利技術的枯草芽孢桿菌J-5可以制成多種生物菌劑，或作為有效成分添加到現有生物菌劑中，當制成芽孢菌劑時，可適應多種保存環境，并具有較長的保質期，在常溫常壓下，可保存1-3年，利于倉儲和運輸。生物樣品保藏信息枯草芽孢桿菌J-5，分類命名為Bacillus subtilis，已于2015年11月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101，菌種保藏號為CGMCC No. 11750。附圖說明圖1為枯草芽孢桿菌J-5在固體LB培養基上培養48小時的菌落形態。圖2為枯草芽孢桿菌J-5復紅染色后的光學顯微鏡下的形態。具體實施方式實施例1 對黃瓜、番茄、茄、甜椒、草莓灰霉病具有拮抗作用的細菌的分離、篩選采集灰霉病害發病嚴重黃瓜、番茄、茄、甜椒、草莓地塊中的健康植株根際土壤作為試驗材料，在實驗室內從該樣品中進行細菌分離，在LB培養基上進行多次分離純化，得到純培養菌落后，以番茄灰霉病菌為指示菌，采用對峙試驗方法進行拮抗性能高的菌株的篩選。具體步驟：上述土壤樣品來自河北省、寧夏、山東、山西等地的染有灰霉病害的黃瓜、番茄、茄、甜椒、草莓種植田地中，將該土壤經梯度稀釋后涂布于PB培養基中，于28℃恒溫培養箱培養。上述培養基根據“微生物培養基手冊”的記載制備得到，培養基配方為：牛肉膏5g ，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂15g，自來水1000ml，pH7.2~7.4，121℃滅菌20min后使用。待平板長出菌落后，挑取不同形態的單菌落采用劃線分離法反復進行分離純化，直到得到單菌落的純培養物，純化后的菌株保存于PB培養基斜面。以番茄灰霉菌為指示菌，采用十字交叉法測定不同菌株對灰霉菌生長的抑制率。將篩選出的細菌菌株點接在距平板中央3cm 處的4個角上，平板中央同時接種直徑5mm 的活化的番茄灰霉病菌塊，每個菌株重復三次，28℃恒溫培養5d，測量、記錄抑菌圈直徑的大小并計算平均抑制率。篩選出了對番茄灰霉菌拮抗作用最強的菌株J-5。并對該菌株進行了保藏，保藏號為CGMCC No.11750。實施例2 拮抗菌株遺傳穩定性的確定將菌株J-5在PB培養基上采用劃線法進行傳代培養，培養20代后，采用平板對峙法測定傳代后的J-5菌株對番茄灰霉菌的拮抗效果，以原始J-5菌株為對照，該拮抗菌株經過20代培養后與原始菌株具有相同的拮抗作用，說明該拮抗菌株具有良好的遺傳穩定性，將抑菌效果穩定的拮抗菌進行PB培養基液體培養，吸取菌液進行-80℃甘油保存。實施例3 拮抗菌株的鑒定 根據《常見細菌系統鑒定手冊》中記載的實驗內容和實驗方法，對篩得的保藏號為CGMCC No.11750的菌株J-5進行鑒定，菌落形態觀測是在PB培養基上進行的，將菌株劃線接種后，于28℃恒溫培養24 小時觀察菌落形態。保藏號為CGMCC No.11750的菌株的菌落近圓形，邊緣嚙蝕狀，臍突狀突起，表面皺褶，顏色為乳白色，無光澤不透明，與培養基結合不緊密。挑取培養24 小時菌苔革蘭氏染色后在光學顯微鏡的100倍油鏡下觀察。在顯微鏡下可以看到，保藏號為CGMCC No.11750的菌株為芽孢桿菌，革蘭氏陽性菌，芽孢位置中生或近中生，芽孢膨大，無伴孢晶體，單個出現。初步確定為芽孢桿菌。 16SrDNA鑒定：將保藏號為CGMCC No.11750的菌株接種到PB培養液，28℃搖床培養24 h，采用天根生化科技（北京）有限公司基因組DNA提取試劑盒提取該菌株的基因組DNA，然后以提取的總DNA 作為模板，以上游引物：F27（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′）和下游引物R1492 (5′- TACGGCTA CCTTGTTA CGAC TT -3 ′)引物對進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μl，反應體系為:基因組DNA 1μL，10×本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種枯草芽孢桿菌J?5，該枯草芽孢桿菌于2015年11月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心進行了保藏，保藏號為：CGMCC?No.?11750。
【技術特征摘要】
1.一種枯草芽孢桿菌J-5，該枯草芽孢桿菌于2015年11月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心進行了保藏，保藏號為：CGMCC No. 11750。2.含有權利要求1所述枯草芽孢桿菌J-5的生物菌劑，其特征在于：其中每克菌劑中枯草芽孢桿菌J-5的含量為4×109cfu/g~7×109cfu。3.根據權利要求2所述的生物菌劑，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：賈振華，金偉偉，黃亞麗，宋水山，馬宏，宋聰，張立文，
申請(專利權)人：河北省科學院生物研究所，
類型：發明
國別省市：河北;13
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