本發明專利技術公開了一種用于檢測羊地方性鼻內腫瘤病毒基因的引物對及其應用，所公開的引物對由SEQ?ID?No.1所示的單鏈DNA和SEQ?ID?No.2所示的單鏈DNA組成。申請人進行的實驗顯示，本發明專利技術所公開的引物對能夠特異性的、高靈敏的判別病羊鼻腔分泌物樣品中是否含有羊地方性鼻內腫瘤病毒基因。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于病毒檢測
，具體涉及一種用于羊地方性鼻內腫瘤病毒檢測的引物對及其在檢測羊地方性鼻內腫瘤病毒中的應用。
技術介紹
羊地方性鼻內腫瘤(enzootic nasal tumor，ENT)是由羊地方性鼻內腫瘤病毒(enzootic nasal tumor virus，ENTV)引起的一種慢性、進行性、接觸傳染性的腫瘤性疾病，該病表現為食欲減退，極度消瘦，呼吸困難，鼻漏，出現鼻內單側或雙側性增生物，至今報道的病例多數為腺癌，少數為乳頭狀腺瘤。本病目前已呈世界性分布，我國的內蒙古、湖南、四川、陜西等地也有該病發生。ENTV感染細胞后可誘導羊鼻內粘膜上皮細胞非急性轉化(即具有致瘤性)，誘導腫瘤的產生。ENT一年四季均可發生，呈地方性流行，也有爆發或散發，發病率5％～16％，死亡率100％。由于該病的潛伏期長達數月甚至數年，引起腫瘤，給養羊業造成了一定的經濟損失。ENTV在分類學上屬于逆轉錄病毒科，β逆轉錄病毒屬的B/D嵌合型逆轉錄病毒。病毒粒子呈圓形，直徑90nm～110nm，有囊膜，核衣殼為二十面體對稱，ENTV的基因組是單股正鏈線性RNA(ssRNA)的二聚體，單體長約7.5kb。目前，我國用于羊地方性鼻內腫瘤的實驗室診斷手段比較落后，主要依據臨床癥狀及其剖檢觀察進行判斷，缺乏快速、簡便的診斷方法。國外已有利用RT-PCR方法從腫瘤組織中檢測羊地方性鼻內腫瘤病毒的報道，但這需要屠宰羊，提取腫瘤組織，所需時間較長，耗時費力，最主要不能進行活體感染羊的檢測。
技術實現思路
本專利技術的一個目的是提供一種可用于羊地方性鼻內腫瘤病毒檢測引物對。本專利技術所提供的用于檢測羊地方性鼻內腫瘤病毒基因的引物對，由SEQ ID No.1所示的單鏈DNA和SEQ ID No.2所示的單鏈DNA組成。上述所公開的引物對特異性的針對羊地方性鼻內腫瘤病毒不同基因中的高度保守區域，能夠準確、快速、方便的判別待測樣品中是否含有羊地方性鼻內腫瘤病毒基因，且具有較高的靈敏度。本專利技術的另一個目的是提供一種用于檢測羊地方性鼻內腫瘤病毒基因的PCR試劑，包含由SEQ ID No.1所示的單鏈DNA和SEQ ID No.2所示的單鏈DNA
組成的引物對。本專利技術的還一個目的是提供一種羊地方性鼻內腫瘤病毒的檢測試劑盒，包含上述的引物對或PCR試劑。本領域技術人員容易理解，作為完整商業和應用封裝的試劑盒，為了提高檢測的準確性，便于進行陰性和陽性對照，上述試劑盒中還可含有羊地方性鼻內腫瘤病毒的陽性對照和陰性對照。本領域技術人員容易理解，為了便于應用，上述試劑盒中還可包含便于快速操作使用的其它輔助試劑，如DNA提取試劑、PCR反應試劑、電泳試劑等，這些成分是PCR擴增檢測中常用的，其用量和使用也為本領域技術人員熟練掌握，此處不予贅述。最后，本專利技術還公開了上述的引物對、PCR試劑、檢測試劑盒在鑒別和檢測羊地方性鼻內腫瘤病毒中的應用。具體的說，是以SEQ ID No.1所示的單鏈DNA和SEQ ID No.2所示的單鏈DNA分別作為上游引物、下游引物，對待測樣品中提取的DNA進行PCR擴增產物；檢測所得PCR擴增產物，若PCR擴增產物具有314bp特異性片段(該片段的堿基排列如SEQ ID No.3所示)，則表明待測樣品羊地方性鼻內腫瘤病毒陽性。相應的，如果沒有擴增出對應片段，則表明待檢樣品中羊地方性鼻內腫瘤病毒陰性。在上述應用中，PCR擴增反應條件可采用常見分子生物學實驗教材上記載的常規條件、時間、溫度、循環次數，作為一種優選，PCR擴增條件為變性溫度94℃、退火溫度55℃、延伸溫度72℃。與已有技術方案相比，本專利技術具有如下技術進步：本專利技術采用的引物對來自羊地方性鼻內腫瘤病毒不同基因中高度保守的區域，能準確、快速、方便的判別病料中是否含有羊地方性鼻內腫瘤病毒，靈敏度達0.5pg；本專利技術的引物對在PCR檢測羊地方性鼻內腫瘤病毒中具有敏感性高、特異性好的特點。附圖說明圖1為PCR擴增產物檢測電泳圖：其中，M為標準分子量DL-2000，1～5為羊地方性鼻內腫瘤的PCR擴增產物；圖2為PCR方法敏感性試驗：其中，1～6為所用模板的量分別為5ng，500pg，50pg，5pg，0.5pg，0.05pg，M為標準分子量DL-2000；圖3為PCR方法檢測羊地方性鼻內腫瘤病毒的特異性試驗：其中，M為標準分子量DL-2000，1為羊地方性鼻內腫瘤患羊腫瘤樣品，2為羊地方性鼻內腫瘤患羊鼻拭子樣品，3為羊口瘡疫苗，4為口蹄疫疫苗，5為小反芻獸疫疫苗，6為山羊痘疫苗，7為正常羊鼻液樣品，8為羊胚胎成纖維細胞樣品，9為陰性對照；圖4為試劑盒保存不同時間后PCR擴增結果：其中，M為標準分子量DL-2000，1為保存一個月，2為保存三個月，3為保存六個月，4為保存九個月，5為保存十二個月；圖5為試劑盒凍融不同次數后PCR擴增結果：其中，M為標準分子量DL-2000，1為凍融1次，2為凍融3次，3為凍融6次，4為凍融10次，5為凍融20次。具體實施方式為了更好的說明本專利技術技術方案的效果及其操作方法，在如下實施例中申請人提供了本專利技術引物對、試劑盒、PCR試劑等的具體類型、規格、用量、操作過程。本領域技術人員容易理解，如下所提供的實現僅為示意性的，并不對本專利技術構成特別限定。本專利技術的保護范圍涵蓋于權利要求及其等同變換。實施例1：引物對以及采用本專利技術引物對和相關PCR試劑的試劑盒的制備羊地方性鼻內腫瘤病毒病料的獲?。号R床病料于2015年8月采自陜西省寶雞市和楊凌高新農業技術示范區羊養殖場發病羊的鼻腔棉拭子共21份，將棉拭子加300μL生理鹽水浸泡20min，轉入1.5mL的EP管，反復凍溶2～3次后，于-20℃保存。引物：上游引物P1(ENTVS)：5’-AATATTTCTTTAGATCTTC-3’，下游引物P2(ENTVA)：5’-CCTAAAAGCTCCATTAGC-3’，預期擴增片段大小為314bp。引物由上海英俊合成，2OD/管。試劑盒所用其它PCR擴增實驗用試劑：DNA提取試劑：購自天根生化科技(北京)有限公司生產的的病毒核酸提取試劑盒(血液組織細胞基因組提取試劑盒DP304)。超純水(ddH2O)：自行過濾制備，1mL/管。2×PCP master Mix：購自北京康為世紀生物科技有限公司，1mL/管。50×TAE電泳緩沖液采用0.5mol/L乙銨四乙酸二鈉((EDTA)溶液(pH8.0)
配制，配置過程為：EDTA 18.61g、滅菌雙蒸水80mL、氫氧化鈉調pH至8.0、滅菌雙蒸水加至100mL。50×TAE電泳緩沖液配制過程為：三羥甲基氨基甲烷(Tris)242g、冰乙酸57.1mL、0.5mol/L EDTA溶液(pH8.0)100mL、滅菌雙蒸水加至1000mL，使用時滅菌雙蒸水稀釋50倍。Glodview核酸染料：購自上海賽百盛基因技術有限公司，1mL/管。上樣緩沖液：購自北京康為世紀生物科技有限公司(2×PCP master Mix中已加入)，1mL/管。將上述試劑和器材封裝到試劑盒中，用量可如下所示：羊地方性鼻內腫瘤病毒陽性對照和陰性對照各500μL；DNA提取試劑：可直接采用天根生化科技(北京)有限公司生產的病毒核酸本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用于檢測羊地方性鼻內腫瘤病毒基因的引物對，其特征在于由SEQ?ID?No.1所示的單鏈DNA和SEQ?ID?No.2所示的單鏈DNA組成。
【技術特征摘要】
1.一種用于檢測羊地方性鼻內腫瘤病毒基因的引物對，其特征在于由SEQ ID No.1所示的單鏈DNA和SEQ ID No.2所示的單鏈DNA組成。2.一種用于檢測羊地方性鼻內腫瘤病毒基因的PCR試劑，其特征在于包含權利要求1中的由SEQ ID No.1所示的單鏈DNA和SEQ ID No.2所示的單鏈DNA組成的引物對。3.一種羊地方性鼻內腫瘤病毒的檢測試劑盒，其特征在于包含權利要求1所述的引物對或權利要求2所述的PCR試劑。4.根據權利要求3的檢測試劑盒，其特征在于包含羊地方性鼻內腫瘤病毒的陽性對照和陰性對...
【專利技術屬性】
技術研發人員：許信剛，付明哲，張琪，何亞鵬，
申請(專利權)人：西北農林科技大學，
類型：發明
國別省市：陜西;61
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