本發明專利技術公開了一種豬TLR4多克隆抗體的制備方法，將重組TLR4蛋白(抗原)與弗氏佐劑乳化后免疫動物獲得多克隆抗體血清；其中，重組TLR4蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1氨基酸序列。試驗表明，本發明專利技術制備的抗體反應性和特異性良好，由于TLR4基因是針對固有免疫應答的重要模式識別受體Toll樣受體家族的成員，其在抗細菌性和病毒性感染疾病中發揮重要的作用，因此本發明專利技術可應用于豬TLR4蛋白的檢測及相關研究，為研究豬細菌性和病毒性感染疾病與TLR4的相互作用機理以及病毒免疫逃避機制的打下良好基礎，為新型疫苗和藥物的研制提供新的靶標。同時，本發明專利技術構建的原核表達載體表達重組蛋白效率高，分離純化方法簡單易操作。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于多克隆抗體制備
，尤其涉及一種豬TLR4多克隆抗體的制備方法和應用。
技術介紹
TLR4屬于I型跨膜蛋白，是TLR家族中極為重要的成員，是固有免疫系統識別病原微生物的主要受體。TLR4可識別革蘭氏陰性菌的脂多糖而在細菌感染性疾病的發生中起重要作用。近年來越來越多的研究發現，TLR4還廣泛參與病毒感染性疾病的發生和病毒的免疫逃逸。TLR4是TLR家族中唯一一個能利用四種接頭分子(MyD88、MAL/TIRAP、TRIF和TRAM)傳遞級聯信號的受體，通過下游IRAK以及TAF3和TRAF6，活化轉錄調節因子，如NF-κB、AP-1和一系列的干擾素調節因子，引起炎性因子和I型干擾素的產生，啟動固有免疫和獲得性免疫應答。近年來，抗病毒固有免疫研究已經取得了重要進展，針對固有免疫應答的重要模式識別受體——Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)所研制的新型疫苗和治療藥物已經在臨床上用于HIV、HBV和HCV的防治。在研究豬細菌性以及病毒性疾病與TLR4(豬Toll樣受體4，Toll-like receptors 4)相互作用過程中，需要運用到Western-blot、IFA、Co-IP以及FCM等多種實驗方法，而這些研究方法無一不需要抗豬TLR4多克隆抗體作為支撐，生物市場上豬源抗體的缺乏嚴重制約著豬TLR4的相關研究。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種豬TLR4多克隆抗體的制備方法，用于研究豬細菌性和病毒性疾病的感染機制，并通過揭示該蛋白抗細菌及病毒的機制，為開發新型疫苗或藥物提供依據。為解決上述技術問題，本專利技術采用以下技術方案：豬TLR4多克隆抗體的制備方法，將重組TLR4蛋白(抗原)與弗氏佐劑乳化后免疫動物獲得多克隆抗體血清；重組TLR4蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1氨基酸序列。免疫動物按以下操作進行：采用第1、7、21、35天背部皮下多點注射的方式免疫8只4周齡昆明小白鼠；首免時，重組蛋白與等量的弗氏完全佐劑混合乳化，每只小鼠蛋白免疫量約500μg；后續免疫則采用等量的弗氏不完全佐劑與重組蛋白進行乳化每只小鼠蛋白免疫量約300-500μg。重組TLR4蛋白是由IPTG誘導基因工程菌表達目的蛋白，并通過低濃度尿素溶液多次洗滌包涵體獲得(純度較高的重組TLR4蛋白)。基因工程菌由TLR4原核表達載體轉化至大腸桿菌Rosetta(DE3)獲得；TLR4原核表達載體是由RT-PCR獲得并構建含有序列表SEQ.ID.No.1堿基序列的重組載體，通過PCR獲得序列表SEQ.ID.No.2堿基序列連接至原核表達質粒pET-32a(+)構建而成。上述制備方法獲得的豬TLR4多克隆抗體。豬TLR4多克隆抗體在制備抗豬瘟病毒疫苗或藥物方面的應用。針對目前缺乏抗豬TLR4多克隆抗體用于研究豬細菌性以及病毒性疾病的現狀，專利技術人建立了一種豬TLR4多克隆抗體的制備方法，將重組TLR4蛋白(抗原)與弗氏佐劑乳化后免疫動物獲得多克隆抗體血清；其中，重組TLR4蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1氨基酸序列。試驗表明，本專利技術制備的抗體反應性和特異性良好，由于TLR4基因是針對固有免疫應答的重要模式識別受體Toll樣受體家族的成員，其在抗細菌性和病毒性感染疾病中發揮重要的作用，因此本專利技術可應用于豬TLR4蛋白的檢測及相關研究，為研究豬細菌性和病毒性感染疾病與TLR4的相互作用機理以及病毒免疫逃避機制的打下良好基礎，為新型疫苗和藥物的研制提供新的靶標。同時，本專利技術構建的原核表達載體表達重組蛋白效率高，分離純化方法簡單易操作。附圖說明圖1是TLR4-KZ大片段DNA PCR電泳圖，圖中：M：DNA Marker DL2000，1：TLR4-KZ大片段DNA PCR產物。圖2是原核表達質粒PCR(左)和EcoR I/Not I雙酶切電泳圖(右)，圖中：M：DNA Marker DL2000/5000，1：原核表達質粒PCR產物，2：原核表達質粒雙酶切產物。圖3是SDS-PAGE分析重組菌pET-TLR4(170)表達的TLR4結果，圖中：M：非預染蛋白Marker，1：未進行誘導的重組菌菌體2：0.05mM IPTG 30℃誘導重組菌6h后收集的菌體，3和4：分別為0.05mM IPTG 30℃誘導重組菌6h后裂解菌體得到的上清和沉淀。圖4是重組蛋白HIS標簽的檢測，圖中：M：預染蛋白Marker。圖5是多克隆抗體與重組蛋白反應性的檢測結果圖，圖中：M：預染蛋白Marker。圖6是多克隆抗體應用的檢測結果圖，圖中：M：預染蛋白Marker，0-48h.p.i分別是PK-15細胞感染豬瘟病毒0、12、24、36和48h后收集的細胞總蛋白。具體實施方式實施例1構建TLR4原核表達載體和基因工程菌。根據GenBank中Sus scrofa toll-like receptor 4(TLR4)mRNA(登錄號：KF460453.1)氨基酸序列分析其親疏水性及線性表位，確定原核表達基因序列為2043-2052共510bp，核苷酸序列和氨基酸序列分別如S序列表SEQ.ID.No.3和序列表SEQ.ID.No.1所示，并設計目的基因的克隆引物F1/R1和原核表達引物F2/R2。采集感染豬瘟病毒的PK-15細胞，抽提細胞總RNA并反轉錄，利用引物F1/R1擴增出TLR4-KZ大片段(621bp)(圖1)，其核苷酸序列如序列表SEQ.ID.No.2所示。以TLR4-KZ質粒為模板，利用引物F2/R2PCR擴增得到原核表達序列TLR4(170)，其核苷酸序列如序列表SEQ.ID.No.3所示。反轉錄體系如下：RNA模板15μL，Oligo dT 1μL，M-MLV反轉錄酶1μL，5×first buffer 5μL，RNase inhibitor 1μL，dNTP 2μL。反轉錄程序為42℃1h，95℃5min。PCR反應體系如下：模板2μL，2×Taq PCR Mastermix 12.5μL，上游引物和下游引物各0.5μL，ddH2O 9.5μL。PCR程序如下：95℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循環30次；72℃終延伸10min。反應結束后進行DNA瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收目的基因片段，與pMD18-T載體連接，所獲得質粒經華大基因公司測序確認與GenBank中目的基因序列一致。設計的克隆引物：F1：5’-GCCGTCATTAGTGCGTCAGTT-3’(SEQ.ID.No.4)，R1：5’-GGCTGTTGTATCATGCTGGTTGCT-3’(SEQ.ID.No.5)。原核表達引物：F2：5’-CGGAATTCTATGGCAGAGGTGAAAGC-3’(SEQ.ID.No.6)，R2：5’-CGGCGGCCGCATGATGATGATGATGATGTGTATCATGCTGGTTGCT-3’(SEQ.ID.No.7)。(下劃線分別為核酸限制性內切酶EcoR I和Not I識別位點)將所獲得的目的基因質粒和原核表達質粒pET-32a(+)同時用核酸限制性內切酶EcoR I和Not I進行雙酶切，純化酶切產物后，通過T4DNA li本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種豬TLR4多克隆抗體的制備方法，其特征在于將重組TLR4蛋白與弗氏佐劑乳化后免疫動物獲得多克隆抗體血清；所述重組TLR4蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1氨基酸序列。
【技術特征摘要】
1.一種豬TLR4多克隆抗體的制備方法，其特征在于將重組TLR4蛋白與弗氏佐劑乳化后免疫動物獲得多克隆抗體血清；所述重組TLR4蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1氨基酸序列。2.根據權利要求1所述的豬TLR4多克隆抗體的制備方法，其特征在于所述免疫動物按以下操作進行：采用第1、7、21、35天背部皮下多點注射的方式免疫8只4周齡昆明小白鼠；首免時，重組蛋白與等量的弗氏完全佐劑混合乳化，每只小鼠蛋白免疫量約500μg；后續免疫則采用等量的弗氏不完全佐劑與重組蛋白進行乳化每只小鼠蛋白免疫量約300-500μg。3.根據權利要求1所述的豬TLR4多克隆抗體的制備方法，其特征在于...
【專利技術屬性】
技術研發人員：羅廷榮，趙倩楠，李曉寧，李曉泉，應雪，陶倩，姜炳星，
申請(專利權)人：廣西大學，
類型：發明
國別省市：廣西;45
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