本發明專利技術公開了一種使胞內蛋白表達至胞外的放線菌信號肽，其命名為Kp?SP，來源于庫克氏菌(Kocuria?sp.3?3)菌株，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，氨基酸序列如SEQ?ID?No.7所示。本發明專利技術還公開了該信號肽在利用構建的重組大腸桿菌表達淀粉酶或纖維素酶中的應用，本發明專利技術的信號肽不僅在常用的表達載體中具有將外源蛋白分泌到胞外的能力，使蛋白表達量增高，酶活明顯提高，并切在組成型表達載體pBSPPc中也具有外源蛋白分泌到胞外的能力，為生產高活性分泌蛋白提供了一條有效途徑。作為一種基礎的基因工程技術，本發明專利技術為生產工業蛋白提供了有利的條件，增強了蛋白的表達量及酶活，降低了分離成本，在蛋白質工業生產方面具有很大的應用前景。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因工程
，具體涉及一種使胞內蛋白表達至胞外的信號肽及其在利用構建的重組大腸桿菌表達淀粉酶、及纖維素酶中的應用。
技術介紹
基因表達是指細胞在生命過程中，把儲存在DNA順序中遺傳信息經過轉錄和翻譯，轉變成具有生物活性的蛋白質分子；基因工程技術中的外源蛋白的表達是指將獲得的外源基因片段通過載體重組到一個新的基因表達宿主中，使其能大量生產具有生物活性的蛋白產物，是當今分子生物學領域應用最廣泛的技術手段之一。隨著生物工業生產工藝的發展，人們對高純度、高產量和高穩定性的重組功能蛋白的需求日益增長，這使得外源蛋白表達技術成為基因工程、生物生產和應用的重要內容。信號肽是引導新合成的蛋白質向分泌通路轉移的短(長度5-30個氨基酸)肽鏈；常指新合成多肽鏈中用于指導蛋白質的跨膜轉移(定位)的N-末端的氨基酸序列(有時不一定在N端)。在起始密碼子后，有一段編碼疏水性氨基酸序列的RNA區域，該氨基酸序列就被稱為信號肽序列，它負責把蛋白質引導到細胞含不同膜結構的亞細胞器內。外源蛋白在宿主菌，如大腸桿菌中的表達形式多為細胞內不溶性表達(包涵體)，少數為細胞外分泌表達。利用信號肽來引導外源蛋白定位分泌到細胞特定區間，提高可溶性，可避免因包涵體復性帶來的困難。研究表明，多種外源基因連接上信號肽后，在原核表達系統，如大腸桿菌、L型細菌、芽孢桿菌和乳酸桿菌中等都得到了分泌表達；信號肽也廣泛應用于真核表達系統如畢赤酵母和昆蟲桿狀病毒表達系統中。目前大腸桿菌中異源表達所用信號肽一般為來源于大腸桿菌自身或者芽孢桿菌，但大多在高效分泌表達中存在通用性不強的缺陷，導致選擇前需要開展大量的信號肽篩選工作。本專利涉及的信號肽來自于放線菌，根據檢索，目前利用放線菌庫克氏菌來源的信號肽進行大腸桿菌重組分泌表達未見報道。
技術實現思路
針對當前研究現狀，本專利技術要解決的問題是提供一種使胞內蛋白表達至胞外的放線菌信號肽及其應用。本專利技術所述的使胞內蛋白表達至胞外的放線菌信號肽，其特征是：所述信號肽命名為Kp-SP，來源于庫克氏菌(Kocuria sp.3-3)菌株，其核苷酸序列長度為90bp，如SEQ ID No.1所示；氨基酸序列長度為29aa，如SEQ ID No.7所示。本專利技術所述使胞內蛋白表達至胞外的放線菌信號肽在利用構建的重組大腸桿菌表達淀粉酶或纖維素酶中的應用。其中：上述淀粉酶是淀粉酶KC441955.1，命名為FSA，來源于Sinomicrobium Pectinilyticus 5DNS001，長度1359bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，氨基酸序列長度為452aa，如SEQ ID No.8所示；或是淀粉酶AAU39594，命名為BLA，來源于Bacillus licheniformis
DSM13，長度1455bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列長度為484aa，如SEQ ID No.9所示；上述纖維素酶ORF3883，命名為CCC，來源于Clostridium cellulosi CS-4-4(Zhang et al.Synergism of Glycoside Hydrolase secretomes from two Thermophilic bacteria cocultivated on lignocellulose.Appl Environ Microbiol(2014)80:2592–2601.)，長度2100bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，氨基酸序列長度為699aa，如SEQ ID No.10所示。上述使胞內蛋白表達至胞外的信號肽在利用構建的重組大腸桿菌表達淀粉酶或纖維素酶中的應用中，所述重組大腸桿菌的構建方法是：(1)根據NCBI數據庫所提供KC441955.1、AAU39594、ORF3883所述的核苷酸序列設計引物；其中，淀粉酶KC441955.1與信號肽Kp-SP重組所用引物為：SFSA-F1：GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SFSA-R1：GCGAGCGCCGATGACAATAATAATTATAC；SFSA-F2：GTATAATTATTATTGTCATCGGCGCTCGC，SFSA-R2：GACGTCGACTTACTCTCCCGAAACCGACCATATG，通過三步PCR將信號肽Kp-SP序列與KC441955.1序列連接，所得重組基因片段命名為SFSA；淀粉酶AAU39594與信號肽Kp-SP重組所用引物為：SBLA-F1：GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SBLA-R1：CTTTAAGATTTGCCGCGGCGCTCG，SBLA-F2：GCGAGCGCCGCGGCAAATCTTAAAG，SBLA-R2：CCCAAGCTTGGGCTATCTTTGAACATAAATTG，通過三步PCR將信號肽Kp-SP序列與AAU39594序列連接，所得重組基因片段命名為SBLA；纖維素酶ORF3883與信號肽Kp-SP重組所用引物為：SCCC-F1：GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SCCC-R1：CTGGGCCGCTTACGGCGCTCGC，SCCC-F2：GCGAGCGCCGTAAGCGGCCCAG，SCCC-R2：GACGTCGACTTACTGCGGTTCAACGCCCCATATC，通過三步PCR將信號肽Kp-SP序列與ORF3883序列連接，所得重組基因片段命名為SCCC；其中：所述KC441955.1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，AAU39594的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，ORF3883的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；對照組為一步PCR獲得的不加信號肽Kp-SP的KC441955.1或AAU39594或ORF3883所示的基因片段；(2)將(1)中得到的三組重組基因片段和對照組基因片段分別與載體pET-Duet或pBSPPc連接，構建獲得重組質粒SFSA-pET-Duet、SFSA-pBSPPc或SBLA-pET-Duet、SBLA-pBSPPc或SCCC-pET-Duet、SCCC-pBSPPc，將所述重組質粒分別轉入感受態大腸桿菌BL21(DE3)中，獲得的重組菌株通過PCR和瓊脂糖凝膠電泳驗證確認；對照組為FSA-pET-Duet、FSA-pBSPPc或BLA-pET-Duet、BLA-pBSPPc或CCC-pET-Duet、CCC-pBSPPc重組質粒轉入感受態大腸桿菌BL21(DE3)中，通過PCR和瓊脂糖凝膠電泳驗證；(3)將(2)中得到的以pET-Duet為載體的重組菌株按照體積比2％的接種量分別接于LB搖管中，培養8-9h，再以體積比1％的接種量轉接于100ml LB搖瓶中，37℃搖床培養，
待OD600nm＝0.4-0.6時，按體積比加入1‰的ITPG，其中，產淀粉酶FSA及SFSA的重組菌株放入20℃搖床過夜培養，產淀粉酶BLA及SBLA的重組菌株于37℃繼續培養4h，產纖維素酶CCC及SCCC的重組菌株于37℃繼續培養4h，所獲菌液離心保留上清，即得到含有淀粉酶或纖維素酶的發酵液；同樣，將(2)中得到的以pBSPPc為載本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種使胞內蛋白表達至胞外的放線菌信號肽，其特征是：所述信號肽命名為Kp?SP，來源于庫克氏菌(Kocuria?sp.3?3)菌株，其核苷酸序列長度為90bp，如SEQ?ID?No.1所示；其氨基酸序列長度為29aa，如SEQ?ID?No.7所示。
【技術特征摘要】
1.一種使胞內蛋白表達至胞外的放線菌信號肽，其特征是：所述信號肽命名為Kp-SP，來源于庫克氏菌(Kocuria sp.3-3)菌株，其核苷酸序列長度為90bp，如SEQ ID No.1所示；其氨基酸序列長度為29aa，如SEQ ID No.7所示。2.權利要求1所述使胞內蛋白表達至胞外的放線菌信號肽在利用構建的重組大腸桿菌表達淀粉酶或纖維素酶中的應用。3.如權利要求2所述的應用，其特征是：所述淀粉酶是淀粉酶KC441955.1，命名為FSA，來源于Sinomicrobium Pectinilyticus 5DNS001，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，氨基酸序列如SEQ ID No.8所示；或是淀粉酶AAU39594，命名為BLA，來源于Bacillus licheniformis DSM13，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列如SEQ ID No.9所示；所述纖維素酶ORF3883，命名為CCC，來源于Clostridium cellulosi CS-4-4，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。4.如權利要求2所述的應用，其特征是：所述重組大腸桿菌的構建方法是：(1)根據NCBI數據庫所提供KC441955.1、AAU39594、ORF3883所述的核苷酸序列設計引物；其中，淀粉酶KC441955.1與信號肽Kp-SP重組所用引物為：SFSA-F1：GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SFSA-R1：GCGAGCGCCGATGACAATAATAATTATAC；SFSA-F2：GTATAATTATTATTGTCATCGGCGCTCGC，SFSA-R2：GACGTCGACTTACTCTCCCGAAACCGACCATATG，通過三步PCR將信號肽Kp-SP序列與KC441955.1序列連接，所得重組基因片段命名為SFSA；淀粉酶AAU39594與信號肽Kp-SP重組所用引物為：SBLA-F1：GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SBLA-R1：CTTTAAGATTTGCCGCGGCGCTCG，SBLA-F2：GCGAGCGCCGCGGCAAATCTTAAAG，SBLA-R2：CCCAAGCTTGGGCTATCTTTGAACATAAATTG，通過三步PCR將信號肽Kp-SP序列與AAU39594序列連接，所得重組基因片段命名為SBLA；纖維素酶ORF3883與信號肽Kp-SP重組所用引物為：SCCC-F1：G...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊春玉，崔延冰，
申請(專利權)人：山東大學，
類型：發明
國別省市：山東;37
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