除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，所述基因包括：(a)編碼SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(b)在嚴(yán)格條件下與(a)限定的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；或(c)SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列。本發(fā)明專利技術(shù)除草劑抗性蛋白質(zhì)特別適合在植物中表達(dá)，尤其定位于葉綠體中表達(dá)，可以增強(qiáng)對(duì)麥草畏除草劑的耐受性，且應(yīng)用前景廣。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，特別是涉及一種對(duì)除草劑麥草畏具有耐受性的蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途。
技術(shù)介紹
雜草可以迅速耗盡土壤中作物和其它目的植物所需要的有價(jià)值的養(yǎng)分。盡管目前可以得到耐受除草劑草甘膦、草丁膦、2,4-D和其它除草劑處理的轉(zhuǎn)基因植物，但是還存在空白區(qū)域，如所控制的雜草范圍、開(kāi)發(fā)額外的除草劑耐受性作物等。此外，耐受上述除草劑的雜草的出現(xiàn)(盡管通常是局部的和可變的)造成了對(duì)額外或備選的雜草控制措施的需要。已經(jīng)證明耐受除草劑性狀在商業(yè)上是有價(jià)值的，因此需要增加耐受其它除草劑的植物和管理難以控制的雜草種類的選項(xiàng)，以避免過(guò)度依賴任何單一除草劑，尤其需要針對(duì)環(huán)境友好的并且在控制雜草方面高度有效的除草劑而開(kāi)發(fā)除草劑耐受性。麥草畏是有效且環(huán)境友好的除草劑之一，其已經(jīng)被農(nóng)民使用40多年了，麥草畏可用于控制玉米、高粱、小米、牧草、干草、牧場(chǎng)、甘蔗、蘆筍、草皮和草籽作物中一年生和多年生闊葉雜草和幾種窄葉雜草；與此同時(shí)，麥草畏可以傷害許多商業(yè)作物和雙子葉植物，如大豆、棉花、豌豆、馬鈴薯、向日葵和油菜，上述作物/植物對(duì)于低水平的麥草畏都是特別敏感的。盡管如此，麥草畏在控制雜草生長(zhǎng)中仍然是有效的，并且是重要的。已報(bào)道從嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonas maltophilia)分離了編碼麥草畏單加氧酶(DMO)的基因，其為鐵氧還蛋白依賴型并賦予對(duì)麥草畏的耐受性。DMO參與將除草劑麥草畏(3,6-二氯-鄰-茴香酸)轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的3,6-二氯水楊酸(DCSA)，表達(dá)DMO基因的植物具有對(duì)麥草畏的耐受性。由于目前發(fā)現(xiàn)的麥草畏耐受型基因均極其相似，所以需要更多新型的麥草畏耐受型基因以避免過(guò)度依賴一種麥草畏耐受型基因，使麥草畏-麥草畏耐受型作物在商業(yè)上具有更廣闊的應(yīng)用空間。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，所述MTHFR66蛋白在植物中對(duì)麥草畏除草劑具有較高的耐受性。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)提供了一種基因，包括：(a)編碼SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(b)在嚴(yán)格條件下與(a)限定的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；或(c)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。所述嚴(yán)格條件可為在6×SSC(檸檬酸鈉)、0.5％SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液中，在65℃下雜交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)還提供了一種表達(dá)盒，包含在有效連接的調(diào)控序列調(diào)控下的所述基因。進(jìn)一步地，所述調(diào)控序列為葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，所述葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽與所述基因有效連接。優(yōu)選地，所述葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核苷酸序列具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)還提供了一種包含所述基因或所述表達(dá)盒的重組載體。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)還提供了一種增加耐受除草劑范圍的方法，包括：將SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或所述表達(dá)盒編碼的蛋白質(zhì)在植物中與至少一種不同于SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或所述表達(dá)盒編碼的蛋白質(zhì)的第二種蛋白質(zhì)一起表達(dá)。進(jìn)一步地，所述第二種蛋白質(zhì)為草甘膦耐受性蛋白質(zhì)、草銨膦耐受性蛋白質(zhì)、α酮戊二酸雙加氧酶、4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶、乙酰乳酸合酶、細(xì)胞色素類蛋白質(zhì)或原卟啉原氧化酶。在本專利技術(shù)中，MTHFR66除草劑抗性蛋白質(zhì)在一種轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)可以伴隨著一個(gè)或多個(gè)草甘膦耐受性蛋白質(zhì)和/或草銨膦耐受性蛋白質(zhì)的表達(dá)。這種超過(guò)一種的除草劑耐受性蛋白質(zhì)在同一株轉(zhuǎn)基因植物中共同表達(dá)可以通過(guò)遺傳工程使植物包含并表達(dá)所需的基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。另外，一種植物(第1親本)可以通過(guò)遺傳工程操作表達(dá)MTHFR66除草劑抗性蛋白質(zhì)，第二種植物(第2親本)可以通過(guò)遺傳工程操作表達(dá)草甘膦耐受性蛋白質(zhì)和/或草銨膦耐受性蛋白質(zhì)。通過(guò)第1親本和第2親本雜交獲得表達(dá)引入第1親本和第2親本的所有基因的后代植物。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)還提供了一種選擇轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的方法，包括：用所述基因或所述表達(dá)盒轉(zhuǎn)化多個(gè)植物細(xì)胞，并在允許表達(dá)所述基因或所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)，而殺死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞或抑制未轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)的除草劑濃度下培養(yǎng)所述細(xì)胞，所述除草劑為麥草畏。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)還提供了一種控制雜草的方法，包括：對(duì)種植植物的大田施用有效劑量的麥草畏除草劑，所述植物包含所述基因、所述表達(dá)盒或所述重組載體。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)還提供了一種保護(hù)植物免受由除草劑引起的損傷的方法，包括：將所述基因、所述表達(dá)盒或所述重組載體導(dǎo)入植物，使導(dǎo)入后的植物產(chǎn)生足夠保護(hù)其免受麥草畏損害量的除草劑耐受性蛋白質(zhì)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)還提供了一種賦予植物麥草畏除草劑耐受性的方法，包括：將所述基因、所述表達(dá)盒或所述重組載體導(dǎo)入植物。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)還提供了一種控制草甘膦耐性植物的大田中草甘膦耐受性雜草的方法，包括：對(duì)種植草甘膦耐受性植物的大田施用有效劑量的麥草畏，所述草甘膦耐受性植物包含所述基因、所述表達(dá)盒或所述重組載體。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)還提供了一種產(chǎn)生麥草畏耐受性植物的方法，包括向所述植物的基因組中引入所述基因或所述表達(dá)盒，以產(chǎn)生麥草畏耐受性植物。具體地，所述產(chǎn)生麥草畏耐受性植物的方法包括：通過(guò)將親本植物自交或與第二種植物雜交而產(chǎn)生麥草畏耐受性植物，所述親本植物和/或第二種植物包含所述基因或所述表達(dá)盒，所述麥草畏耐受性植物遺傳了來(lái)自所述親本植物和/或第二種植物的所述基因或所述表達(dá)盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)還提供了一種培養(yǎng)對(duì)麥草畏除草劑具有耐受性的植物的方法，包括：種植至少一粒植物種子，所述植物種子的基因組中包括所述基因或所述表達(dá)盒；使所述植物種子長(zhǎng)成植株；用有效劑量麥草畏除草劑噴灑所述植株，收獲與其他不具有所述基因或所述表達(dá)盒的植株相比具有減弱的植物損傷的植株。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，優(yōu)選地，所述植物為大豆、棉花、玉米、水稻、小麥、甜菜或甘蔗。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)還提供了一種甲基四氫葉酸還原酶耐受麥草畏除草劑的用途，所述甲基四氫葉酸還原酶具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)還提供了一種產(chǎn)生甲基四氫葉酸還原酶的植物耐受麥草畏除草劑的用途，所述甲基四氫葉酸還原酶具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。將所述的基因或所述的表達(dá)盒或所述的重組載體導(dǎo)入植物，在本專利技術(shù)中為將外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞，常規(guī)轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的DNA導(dǎo)入。本專利技術(shù)可以增加植物對(duì)于氧化應(yīng)激的耐受性，包括但不限于，向植物群提供麥草畏或麥草畏單加氧酶所介導(dǎo)代謝的產(chǎn)物或其類似物，以改善植物的除草劑耐受性，例如，通過(guò)將麥草畏代謝為DCSA。本專利技術(shù)“麥草畏”(Dicamba)是指3,6-二氯-鄰-茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基
苯甲酸及其酸和鹽。其鹽包括異丙胺鹽、二甘醇銨鹽、二甲胺鹽、鉀鹽和鈉鹽。麥草畏的商業(yè)制劑包括但不限于，(作為DMA鹽)、(BASF，作為DGA鹽)、VEL-58-CS-11TM和(BASF，作為DGA鹽)。目前已經(jīng)報(bào)道的含甲氧基芳烴化合物脫甲基酶有4種，分別是(1)RHOs(Rieske非血紅素型氧化酶)，降解麥草畏的DMO本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種基因，其特征在于，包括：(a)編碼SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(b)在嚴(yán)格條件下與(a)限定的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；或(c)SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種基因，其特征在于，包括：(a)編碼SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(b)在嚴(yán)格條件下與(a)限定的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；或(c)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。2.一種表達(dá)盒，其特征在于，包含在有效連接的調(diào)控序列調(diào)控下的權(quán)利要求1所述基因。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述表達(dá)盒，其特征在于，所述調(diào)控序列為葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，所述葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽與權(quán)利要求1所述基因有效連接。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述表達(dá)盒，其特征在于，所述葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核苷酸序列具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。5.一種包含權(quán)利要求1所述基因或權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述表達(dá)盒的重組載體。6.一種增加耐受除草劑范圍的方法，其特征在于，包括：將SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述表達(dá)盒編碼的蛋白質(zhì)在植物中與至少一種不同于SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述表達(dá)盒編碼的蛋白質(zhì)的第二種蛋白質(zhì)一起表達(dá)。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述增加除草劑耐受性的方法，其特征在于，所述第二種蛋白質(zhì)為草甘膦耐受性蛋白質(zhì)、草銨膦耐受性蛋白質(zhì)、α酮戊二酸雙加氧酶、4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶、乙酰乳酸合酶、細(xì)胞色素類蛋白質(zhì)或原卟啉原氧化酶。8.一種選擇轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的方法，其特征在于，包括：用權(quán)利要求1所述基因或權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述表達(dá)盒轉(zhuǎn)化多個(gè)植物細(xì)胞，并在允許表達(dá)所述基因或所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)，而殺死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞或抑制未轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)的除草劑濃度下培養(yǎng)所述細(xì)胞，所述除草劑為麥草畏。9.一種控制雜草的方法，其特征在于，包括：對(duì)種植植物的大田施用有效劑量的麥草畏除草劑，所述植物包含權(quán)利要求1所述基因、權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述表達(dá)盒或權(quán)利要求5所述重組載體。10.一種保護(hù)植物免受由除草劑引起的損傷的方法，其特征在于，包括：將權(quán)利要求1所述基因、權(quán)利要求2-4任一...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：何健，姚利，賈興軍，謝香庭，吳業(yè)春，陶青，丁德榮，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：北京;11