本發明專利技術提供全懸浮培養型Marc?145細胞系的馴化方法，步驟如下：（1）貼壁培養型Marc?145細胞的培養；（2）低血清貼壁培養型Marc?145細胞系的馴化；（3）低血清全懸浮培養型Marc?145細胞的馴化；（4）無血清全懸浮培養型Marc?145細胞的馴化。應用本發明專利技術的細胞馴化方法能夠得到懸浮培養的Marc?145細胞，該細胞適應低血清和無血清全懸浮培養，在7.5L的反應器按無血清培養密度可達8×106/ml，至少可得到4.4×1010的細胞，相當于80?90個15L滾瓶或18?20個40層細胞工廠收獲的細胞數量，發明專利技術效果明顯。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及全懸浮培養型Marc-145細胞系的馴化方法。
技術介紹
Marc-145細胞是1993年Kim HS等從恒河猴胚腎細胞MA-104中克隆得到的上皮細胞，該細胞可連續傳代呈貼壁型生長，是目前研究和生產豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV，俗稱“藍耳病”)及疫苗最理想的細胞株，還可用于雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)和豬細小病毒(Porcine parvovirus virus，PPV)等病毒的體外增殖。因Marc-145為貼壁型生長，在病毒培養和疫苗生產時該細胞均采用貼壁單層培養，細胞的量受制于容器(如：細胞工廠、滾瓶)或介質(如：微載體)的表面積，大規模生產時需要足夠大的廠房或價格昂貴的微載體以及大量的人工操作，而且生物反應器微載體培養目前在放大培養時仍存在許多技術難題沒有解決，推廣應用仍有難度。現階段工業化單層培養Marc-145細胞時，培養基中均加一定比例的牛血清(包括胎牛血清或新生牛血清)細胞才能正常生長，牛血清不僅價格貴，而且牛血清來源于自然生物體，牛源本身攜帶和采集加工過程有污染外源微生物和致病因子的可能，使用會存在生物安全風險。另外，牛血清是一種天然混合物，其具體成份目前還沒有完全分析清楚，生物制品生產中使用后對下游純化工藝造成困難，如果有殘留通常會引起接種者的副反應而影響產品質量。生物制品生產中細胞培養如能采用無血清全懸浮工藝，培養規模就容易線性放大，避免了細胞貼壁培養和使用牛血清帶來的工藝缺陷，可提高病毒產量和產品質量，但是馴化無血清全懸浮培養型細胞株是目前最關鍵的技術瓶頸之一。本專利技術提供一種低血清和無血清高密度全懸浮培養型Marc-145細胞及其制備方法和應用方法，為用全懸浮培養Marc-145細胞生產PRRSV疫苗提供細胞基質及制備方法和培養方法。
技術實現思路
本專利技術提供了全懸浮培養型Marc-145細胞系的馴化方法，并提供了馴化后的全懸浮培養型Marc-145細胞的擴大培養方法。本專利技術提供全懸浮培養型Marc-145細胞系的馴化方法，步驟如下：(1)貼壁培養型Marc-145細胞的培養 選用經無菌、支原體、外源病毒檢定為陰性，對PRRSV敏感的貼壁培養型Marc-145細胞，待細胞生長致密單層后用含10％新生牛血清的DMEM培養液按1：4比例分瓶傳代，置37℃5％CO2的培養箱培養，在48-72h內細胞形成致密單層，為邊緣清晰的扁平上皮型細胞且細胞生長正常的情況下可用于馴化；(2)低血清貼壁培養型Marc-145細胞系的馴化 a)將步驟(1)所述生長正常的貼壁培養型Marc-145細胞分別用含新生牛血清8％、5％的DMEM培養液各培養三代。每次傳代的標準是按1∶4比例分瓶，在37℃5％CO2培養，在48-72h內細胞形成致密單層；b)將培養液換成DMEM/F12后加5％新生牛血清繼續培養三代，傳代標準同步驟a)；c)培養液中新生牛血清降為3％，按b步驟中的方法，傳代比例降為1∶3再培養三代；d)培養液中新生牛血清降為1％，在培養液中再加體積百分含量20％上一代次培養了該細胞48-72h的培養液繼續培養五代，傳代標準同步驟c)；細胞在48h-72h內形成致密單層，馴化得到了低血清貼壁培養型Marc-145細胞系；(3)低血清全懸浮培養型Marc-145細胞的馴化 a)將步驟(2)馴化的低血清貼壁培養型Marc-145細胞，用DMEM/F12和無血清培養基1號按體積比1∶1比例混合后，加3-5％新生牛血清制成培養液，用培養液將細胞密度調整至3-5×105/ml，100-130r/min、37℃5％CO2搖床培養；b)每培養48h取樣計數，細胞密度未達到1×106/ml時，800-1000r/min離心后換用新鮮培養液重新懸浮培養；細胞密度達到1×106/ml時，800-1000r/min離心按1∶2比例分瓶培養；至細胞密度達到2×106/ml時，800-1000r/min離心按1∶3比例分瓶培養；在連續三代按1∶3比例培養48h細胞密度均達2×106/ml時，馴化得到低血清全懸浮培養型Marc-145細胞系；(4)無血清全懸浮培養型Marc-145細胞的馴化 a)在無血清培養基2號(蘭州百靈生物技術有限公司，貨號：BFLM101.05)中加3％新生牛血清，將步驟(3)中得到的低血清全懸浮培養型Marc-145細胞直接稀釋到密度5-7×105/ml，置100-130r/min、37℃5％CO2搖床培養；b)每培養24h取樣計數，細胞密度達到3×106/ml時，將細胞懸液直接稀釋至5×105/ml接種培養，每培養一代新生牛血清濃度下降1％，到第4代時血清降為0，完全用無血清培養培養，在連續三代培養48h細胞密度均達3×106/ml時，馴化得到無血清全懸浮培養型Marc-145細胞系。本專利技術還提供應用權利要求1所述的方法得到的全懸浮培養型Marc-145細胞。本專利技術還提供全懸浮培養型Marc-145細胞在無血清培養基中的培養方法，步驟如下：a)種子細胞培養，復蘇一支全懸浮培養型Marc-145細胞，用40-60ml無血清培養基2號加5-10％新生牛血清，置110r/min、37℃5％CO2培養；當細胞生長至3×106/ml以上時，用無血清培養基2號加1-3％新生牛血清的培養液將細胞稀釋至密度為5-7×105/ml，計250-350ml，100r/min、37℃5％CO2培養；擴大培養至細胞密度達3×106/ml以上時，再用無血清培養基2號直接將細胞稀釋至密度為5-7×105/ml繼續擴大培養，總體積為400-600ml；培養條件為：100-130r/min、37℃5％CO2；細胞密度達3×106/ml以上時，轉入生物反應器培養；b)生物反應器批培養：用無血清培養基2號接種密度為5-7×105/ml的全懸浮培養型Marc-145細胞至生物反應器培養體積，培養條件為：轉速70-120r/min、溫度37℃、溶氧40-70％、pH7.15-7.25。本專利技術還提供全懸浮培養型Marc-145細胞在無血清培養基中的培養方法，步驟如下：用無血清培養基2號接種全懸浮培養型Marc-145細胞至生物反應器培養，起始細胞密度為5-7×105/ml，起始培養體積比生物反應器培養允許最小體積多10-20％，培養條件為：轉速50-70r/min、溫度37℃、溶氧25-40％、pH7.15-7.25；細胞密度達2×106/ml以上時補加與起始培養體積相等的無血清培養基2號，培養條件改為：轉速70-90r/min、溫度37℃、溶氧35-45％、pH7.15-7.25；細胞密度達4×106/ml以上時補加無血清培養基2號至最高培養體積，培養條件改為：轉速90-120r/min、溫度37℃、溶氧50-70％、pH7.10-7.20。本專利技術還提供全懸浮培養型Marc-145細胞在低血清培養基中的培養方法，步驟如下：用無血清培養基2號加1-3％新生牛血清接種全懸浮培養型Marc-145細胞至生物本文檔來自技高網...
【技術保護點】
全懸浮培養型Marc?145細胞系的馴化方法，其特征在于：步驟如下：（1）貼壁培養型Marc?145細胞的培養選用經無菌、支原體、外源病毒檢定為陰性，對PRRSV敏感的貼壁培養型Marc?145細胞，待細胞生長致密單層后用含10%新生牛血清的DMEM培養液按1：4比例分瓶傳代，置37℃?5%?CO2的培養箱培養，在48?72h內細胞形成致密單層，為邊緣清晰的扁平上皮型細胞且細胞生長正常的情況下可用于馴化；（2）低血清貼壁培養型Marc?145細胞系的馴化a)將步驟（1）所述生長正常的貼壁培養型Marc?145細胞分別用含新生牛血清8%、5%的DMEM培養液各培養三代；每次傳代的標準是按1：4比例分瓶，在37℃5%CO2培養，在48?72h內細胞形成致密單層；b)將培養液換成DMEM/F12后加5%新生牛血清繼續培養三代，傳代標準同步驟a)；c)培養液中新生牛血清降為3%，按b步驟中的方法，傳代比例降為?1：3再培養三代；d）培養液中新生牛血清降為1%，在培養液中再加體積百分含量20%上一代次培養了該細胞48?72h的培養液繼續培養五代，傳代標準同步驟c)；細胞在48h?72h內形成致密單層，馴化得到了低血清貼壁培養型Marc?145細胞系；（3）低血清全懸浮培養型Marc?145細胞的馴化a)將步驟（2）馴化的低血清貼壁培養型Marc?145細胞，用DMEM/F12和無血清培養基1號按體積比1：1比例混合后，加3?5%新生牛血清制成培養液，用培養液將細胞密度調整至3?5×105/ml，100?130r/min、37℃?5%?CO2搖床培養；b)每培養48h取樣計數，細胞密度未達到1×106/ml時，800?1000r/min離心后換用新鮮培養液重新懸浮培養；細胞密度達到1×106/ml時，800?1000r/min離心按1：2比例分瓶培養；至細胞密度達到2×106/ml時，800?1000r/min離心按1：3比例分瓶培養；在連續三代按1：3比例培養48h細胞密度均達2×106/ml時，馴化得到低血清全懸浮培養型Marc?145細胞系；（4）無血清全懸浮培養型Marc?145細胞的馴化a)?在無血清培養基2號中加3%新生牛血清，將步驟（3）中得到的低血清全懸浮培養型Marc?145細胞直接稀釋到密度5?7×105/ml，置100?130r/min、37℃5%CO2搖床培養；b)每培養24h取樣計數，細胞密度達到3×106/ml時，將細胞懸液直接稀釋至5×105/ml接種培養，每培養一代新生牛血清濃度下降1%，到第4代時血清降為0，完全用無血清培養培養，在連續三代培養48h細胞密度均達3×106/ml時，馴化得到無血清全懸浮培養型Marc?145細胞系。...
【技術特征摘要】
1.全懸浮培養型Marc-145細胞系的馴化方法，其特征在于：步驟如下：（1）貼壁培養型Marc-145細胞的培養選用經無菌、支原體、外源病毒檢定為陰性，對PRRSV敏感的貼壁培養型Marc-145細胞，待細胞生長致密單層后用含10%新生牛血清的DMEM培養液按1：4比例分瓶傳代，置37℃ 5% CO2的培養箱培養，在48-72h內細胞形成致密單層，為邊緣清晰的扁平上皮型細胞且細胞生長正常的情況下可用于馴化；（2）低血清貼壁培養型Marc-145細胞系的馴化a)將步驟（1）所述生長正常的貼壁培養型Marc-145細胞分別用含新生牛血清8%、5%的DMEM培養液各培養三代；每次傳代的標準是按1：4比例分瓶，在37℃5%CO2培養，在48-72h內細胞形成致密單層；b)將培養液換成DMEM/F12后加5%新生牛血清繼續培養三代，傳代標準同步驟a)；c)培養液中新生牛血清降為3%，按b步驟中的方法，傳代比例降為 1：3再培養三代；d）培養液中新生牛血清降為1%，在培養液中再加體積百分含量20%上一代次培養了該細胞48-72h的培養液繼續培養五代，傳代標準同步驟c)；細胞在48h-72h內形成致密單層，馴化得到了低血清貼壁培養型Marc-145細胞系；（3）低血清全懸浮培養型Marc-145細胞的馴化a)將步驟（2）馴化的低血清貼壁培養型Marc-145細胞，用DMEM/F12和無血清培養基1號按體積比1：1比例混合后，加3-5%新生牛血清制成培養液，用培養液將細胞密度調整至3-5×105/ml，100-130r/min、37℃ 5% CO2搖床培養；b)每培養48h取樣計數，細胞密度未達到1×106/ml時，800-1000r/min離心后換用新鮮培養液重新懸浮培養；細胞密度達到1×106/ml時，800-1000r/min離心按1：2比例分瓶培養；至細胞密度達到2×106/ml時，800-1000r/min離心按1：3比例分瓶培養；在連續三代按1：3比例培養48h細胞密度均達2×106/ml時，馴化得到低血清全懸浮培養型Marc-145細胞系；（4）無血清全懸浮培養型Marc-145細胞的馴化a) 在無血清培養基2號中加3%新生牛血清，將步驟（3）中得到的低血清全懸浮培養型Marc-145細胞直接稀釋到密度5-7×105/ml，置100-130r/min、37℃5%CO2搖床培養；b)每培養24h取樣計數，細胞密度達到3×106/ml時，將細胞懸液直接稀釋至5×105/ml接種培養，每培養一代新生牛血清濃度下降1%，到第4代時血清降為0，完全用無血清培養培養，在連續三代培養48h細胞密度均達3×106/ml時，馴化得到無血清全懸浮培養型Marc-145細胞系。2.應用權利要求1所述的方法得到的全懸浮培養型Marc-1...
【專利技術屬性】
技術研發人員：喬自林，馬忠仁，徐水林，王家敏，令世鑫，馮玉萍，
申請(專利權)人：西北民族大學，
類型：發明
國別省市：甘肅;62
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