抗人降鈣素原抗體及其應用制造技術

本發明專利技術涉及抗人降鈣素原抗體及其應用。本發明專利技術制備了多種抗體，并進行配對篩選，獲得靈敏度及特異性均能滿足需求的抗體組合；同時其方便大量生產，可滿足日后大規模臨床應用的需求。對上述抗體組合進行檢測體系的調試優化工作，獲得操作簡便，靈敏度，特異性及相關檢測性能可滿足人臨床樣本檢測的人降鈣素原的時間分辨免疫熒光層析定量檢測卡。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，具體的涉及一種抗人降鈣素原(PCT)抗體及其制備方法以及上述抗體在人降鈣素原檢測中的應用。
技術介紹
降鈣素原(Procalcitonin，PCT)是一種無激素活性的糖蛋白，由降鈣蛋白、降鈣素、N端殘基片段組成，是降鈣素(Calcitonin，CT)的前體，相對分子量13KDa，半衰期25-30小時。生理條件下，PCT主要由甲狀腺濾泡旁C細胞產生；病理狀態下，PCT可來源于肝、肺等多種器官和組織。PCT在臨床上具有廣泛而又重要的應用價值。健康人血漿PCT含量極低，在正常人血中低于0.5ng/ml。當發生嚴重細菌、真菌、寄生蟲感染以及膿毒癥和多臟器功能衰竭時，它在血漿中的水平升高；而發生自身免疫、過敏和局部感染、病毒感染、慢性非特異性炎癥、癌癥發熱、移植物宿主排斥反應等疾病時，PCT水平不會升高；這就決定了PCT的高度特異性，因此可用于各種臨床情況的鑒別診斷。此外，PCT濃度和炎癥嚴重程度成正相關，并隨著炎癥的控制和病情的緩解而降低至正常水平，因而PCT又可作為判斷病情與預后的可靠指標。PCT可在感染后2個小時后檢測到，對臨床早期診斷具有重要意義，在感染后12～24小時達到高峰。目前檢測PCT常用的實驗室方法有放射免疫學分析法(RIA)、化學發光免疫分析法(CLIA)、膠體金比色法(GICA)和酶聯免疫法(ELISA)。放射免疫學分析法是利用人工合成的多克隆抗體特異地識別和連接降鈣素原。該方法能檢測正常人的血清PCT，但檢測的是游離PCT、結合型PCT和降鈣素基因相關肽前體的混合物，而不能區分上述三種物質；且存在檢測耗時長(19～22h)，有放射性元素的污染，標記物穩定性差，廢棄物難以處理等缺點而使其應用受到限制。化學發光免疫分析法(CLIA)一般需要配套昂貴的全自動電化學發光檢測儀，常規實驗室無法開展，而且給患者帶來不必要的費用，增加患者負擔。而利用生物素-親和素系統檢測PCT的電化學發光免疫試劑盒，也需要配套昂貴的全自動電化學發光檢測儀，常規實驗室無法開展，而且給患者帶來不必要的費用，增加患者負擔。而本專利技術膠體金檢測試紙條可滿足快速檢測及床邊檢測的需求且無需專業技術人員。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供能有效的、特異性結合人降鈣素原的抗體。更具體地說：本專利技術的第一目的在于提供一種抗人降鈣素原抗體，其重鏈可變區含有以下的互補決定區：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；以及其輕鏈可變區序列含有以下的互補決定區：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR3。優選的是本專利技術中的抗體的重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。本專利技術第二個目的是提供一種單鏈抗體，所述單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。本專利技術第三個目的是提供一種編碼上述單鏈抗體的核苷酸序列，編碼單鏈抗體的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。本專利技術第四個目的是提供一種含有上述核苷酸序列的表達載體。本專利技術第五個目的是提供一種含有上述表達載體的重組宿主細胞。所屬宿主細胞可以是大腸桿菌、酵母或哺乳動物細胞，優選為畢赤酵母。本專利技術第六個目的是提供一種生產上述單鏈抗體的方法，包括：1)在合適的條件下培養上述重組宿主菌表達抗體；2)然后從宿主菌中純化、收集抗體。本專利技術的第七個目的在于提供上述抗人降鈣素原抗體在檢測人降鈣素原含量中的應用。本專利技術的第八個目的在于提供一種可配對檢測人降鈣素原的抗體對：外購抗降鈣素原抗體MJG03(購于杭州啟泰生物技術有限公司，編號為MJG03)和本專利技術的抗人降鈣素原抗體；該抗體對組合的檢測靈敏度高，特異性好。本專利技術的第九個目的在于提供一種利用所述抗人降鈣素原抗體檢測人降鈣素原的膠體金免疫層析定量檢測卡，包括樣品墊、金標墊、反應膜和吸水墊；所述金標墊噴涂有膠體金顆粒標記的本專利技術的抗人降鈣素原抗體或MJG03，所述反應膜上有檢測帶和質控帶，檢測帶位置包被有抗體MJG03或本專利技術的抗人降鈣素原抗體，質控帶位置包被抗His標簽抗體或Protein L。本專利技術制備了多種抗體，并與商業化抗體進行配對篩選，獲得靈敏度及特異性均能滿足需求的抗體組合(本專利技術的抗人降鈣素原抗體及MJG03)；同時其方便大量生產，可滿足日后大規模臨床應用的需求。對上述抗體組合進行檢測體系的調試優化工作，獲得操作簡便，
靈敏度，特異性及相關檢測性能均可滿足人臨床樣本檢測的人降鈣素原的膠體金免疫層析定量檢測卡。附圖說明圖1.抗體重鏈及輕鏈可變區基因電泳圖。Lane 1為200bp DNA Ladder；Lane 2為本專利技術的人降鈣素原抗體重鏈可變區DNA；Lane 3為本專利技術的人降鈣素原抗體輕鏈可變區DNA。圖2.單鏈抗體結構示意圖。VH表示重鏈可變區序列，VL表示輕鏈可變區序列，His標簽為六個組氨酸。圖3.單鏈抗體基因PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖4.重組單鏈抗體畢赤酵母菌株誘導表達上清培養液SDS-PAGE電泳鑒定圖。圖5.SDS-PAGE鑒定單鏈抗體純化效果圖。圖6.本專利技術膠體金免疫層析定量檢測卡結構示意圖。1為樣品墊、2為反應膜、3為吸收墊、4為質控線(C線)、5為檢測線(T線)、6為金標墊、7為PVC片材。圖7.本專利技術膠體金免疫層析定量檢測卡檢測范圍擬合曲線。其中橫坐標為蛋白濃度(ng/mL)；縱坐標為檢測值；r2為0.999。圖8.本專利技術膠體金免疫層析定量檢測卡線性范圍擬合曲線。其中橫坐標為理論濃度(ng/mL)；縱坐標為檢測值；r2為0.998。圖9.本專利技術膠體金免疫層析定量檢測與市售同類產品比對結果相關性。具體實施方式定義“抗體”又稱免疫球蛋白，是一類由B淋巴細胞分泌的大型Y形蛋白質，能夠通過Y形的其中兩個分叉頂端的互補位點(抗原結結合位)特異性結合靶抗原的免疫球蛋白分子，所述靶抗原如蛋白質、糖、多核苷酸、脂、多肽、小分子化合物等。“單鏈抗體”(scFv)指的是抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)通過15～20個氨基酸短肽(linker)連接形成的單一鏈融合蛋白，用于連接的linker通常富含甘氨酸和絲氨酸，以利于單鏈抗體的穩定性與柔韌性。連接方式可將VL的N端連接至VH的C末端，或者相反。盡管去除了恒定區并引入linker，單鏈抗體依然保留了抗體對抗原的特異性，且其具有分子量小、穿透力強和抗原性弱等特點。互補決定區(complementarity-determining region，CDR)，也叫做高變區。成型于抗
體單體氨基酸的末端，是靶抗原與抗體結合的最關鍵區域，在免疫網絡理論中，每個抗體的互補決定區又被稱為獨特型或者基因型。實施例1.抗人降鈣素原雜交瘤細胞株的制備1.動物免疫以人重組降鈣素原按照一般免疫程序免疫BALB/c雌性小鼠(購自常州卡文斯實驗動物有限公司)。具體免疫情況參見《抗體制備與使用實驗指南》。采用間接ELISA法跟蹤免疫小鼠血清滴度，選取血本文檔來自技高網...

【技術保護點】
抗人降鈣素原抗體，包括：重鏈可變區含有以下的互補決定區：氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示的HCDR1、如SEQ?ID?NO：2所示的HCDR2和/或如SEQ?ID?NO：3所示的HCDR3；以及輕鏈可變區序列含有以下的互補決定區：氨基酸序列如SEQ?ID?NO：4所示的LCDR1、如SEQ?ID?NO：5所示的LCDR2和/或如SEQ?ID?NO：6所示的LCDR3。

【技術特征摘要】
1.抗人降鈣素原抗體，包括：重鏈可變區含有以下的互補決定區：氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如SEQ ID NO：2所示的HCDR2和/或如SEQ ID NO：3所示的HCDR3；以及輕鏈可變區序列含有以下的互補決定區：氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如SEQ ID NO：5所示的LCDR2和/或如SEQ ID NO：6所示的LCDR3。2.如權利要求1所述的抗人降鈣素原抗體，其特征是所述抗體的重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示、輕鏈可變區的氨基酸...

【專利技術屬性】
技術研發人員：馬永，趙利利，王安良，范宇，
申請(專利權)人：江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇;32