本發明專利技術公開了一種豬溶菌酶來源的飼用抗菌十二肽及其制備方法，屬于生物工程領域。本發明專利技術的制備方法包括了粗提液的制備，凝膠過濾色譜柱Superdux?Peptide?10/300GL的分離，和反相柱Phenomenex?luna?C18分離純化。經LC?MS鑒定，該抗菌十二肽的氨基酸序列為：G?V?S?L?A?N?W?V?C?L?A?K，此抗菌肽屬于堿性肽，對革蘭氏陰性菌具有明顯抗性，是對豬溶菌酶的抗菌譜的良好補充和拓展。經與抗菌肽數據庫(The?Antimicrobial?Peptide?Database)等數據庫比對，此種抗菌肽并未見報道。本發明專利技術制備工藝具有簡單、高效的特點，產物純度經質譜鑒定可達95％以上。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種豬溶菌酶來源的飼用抗菌十二肽及其制備方法，屬于生物工程領域。
技術介紹
幾十年來，抗生素通過抑制病原微生物增殖，減少其代謝毒素對動物的毒害作用而在防治動物的疾病、促進動物的生長、提高畜禽產品的產量等方面起到了積極的作用。但是長期的使用抗生素，尤其是飼養過程中使用抗病藥物、促生長添加劑等，會造成藥物的殘留超標，產地的環境污染，導致肌肉的品質和加工產品的質量下降。除此之外，禽畜長期使用抗生素作飼料添加劑，可使某些菌群變為耐藥菌株，從而帶來預防與治療人畜某些疾病的困難。歐盟監管委員會決定，自2006年1月起在動物養殖業中禁用抗生素生長促進劑。從2013年12月開始，美國FDA發布了《獸醫飼料指令》，要求有執照的獸醫監督抗生素的使用，計劃從2014年起，用3年時間禁止在牲畜飼料中使用預防性抗生素，最大限度地減少食用牲畜帶給消費者抗生素耐藥性問題。韓國也計劃在2018年7月全面禁止飼用抗生素的使用。隨著細菌對抗生素耐藥性和抗生素的殘留問題日益嚴重，研究和開發綠色飼料添加劑產品已經成為世界性的研究課題，大量研究表明，中草藥提取物、微生物制劑、酶制劑、益生元、抗菌肽、酸化劑等新型飼料添加劑能有效減少或者替代飼用抗生素的使用。其中，溶菌酶來自動物體內，因為其同源性和高效性而備受人們親睞。豬溶菌酶是豬體內抵抗外源微生物侵染的一道重要屏障，是其非特異性免疫的重要組成部分。鑒于豬在畜牧業中的重要地位，豬溶菌酶的規模化生產問題已經提上日程。然而，與其他C-型溶菌酶的作用類似，豬溶菌酶的抗菌譜主要集中在革蘭氏陽性菌，對革蘭氏陰性菌基本沒有抑菌作用，這也限制了它的應用。
技術實現思路
為了解決上述問題，本專利技術利用蛋白酶將豬溶菌酶水解成不同的片段，利用超濾和色譜等技術，制備得到了對革蘭氏陰性菌具有明顯抗性的活性肽并得到了抗菌肽的氨基酸序列。本專利技術的制備工藝簡單、分離效果好、操作條件溫和，獲得的抗菌肽純度高、具有較高的抗菌活性，可作為生物防治使用，是對豬溶菌酶抗菌譜的有效補充和完善。本專利技術的第一個目的是提供一種抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列為：G-V-S-L-A-N-W-V-C-L-A-K(如SEQ ID NO.1所示)，命名為SSL-LP。所述抗菌肽是利用蛋白酶將豬溶菌酶水解，然后經分離純化得到的。本專利技術的第二個目的是提供一種所述抗菌肽的制備方法，是將豬溶菌酶進行胰蛋白酶水解得到粗提液，然后經凝膠過濾色譜Superdux Peptide 10/300GL和反相柱C18Phenomenex luna分離純化得到抗菌十二肽SSL-LP。在本專利技術的一種實施方式中，所述豬溶菌酶由重組大腸桿菌發酵而來，發酵產品經胰蛋白酶，于35～38℃水解12～16h，酶解結束后煮沸滅酶，酶解液超濾濃縮，得到粗提液。在本專利技術的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌，是以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主，表達編碼基因(NCBI-ID:1174173)，以pET-28a(+)為表達載體，在25℃、200r/min條件下，利用0.1mmol/L的IPTG誘導8h，離心發酵液獲得菌體。對其進行超聲破碎獲得重組蛋白包涵體，然后對包涵體進行復性，冷凍干燥后最終獲得了具有生物活性的豬溶菌酶。在本專利技術的一種實施方式中，胰蛋白酶相對發酵產物的添加量為15-30mg/g。在本專利技術的一種實施方式中，所述超濾濃縮是采用截留分子量3000Da的超濾裝置濃縮8～10倍。在本專利技術的一種實施方式中，所述分離純化是：(1)將粗提液用磷酸鹽緩沖液透析后，用Superdux Peptide 10/300GL凝膠色譜分離，收集對大腸桿菌、銅綠假單細胞菌、肺炎克雷伯氏菌等均有抑菌作用的活性峰Ⅴ(指色譜圖上出現的第5個峰，下同)，用截留分子量為3000Da的超濾膜超濾濃縮，取分子量較小的部分透析后冷凍干燥；(2)將上一步得到的冷凍干燥的樣品用5％的乙腈(含0.1％TFA，下同)溶解，并經5％的乙腈(含0.1％TFA)平衡的C18Phenomenex luna柱，用濃度為5-50％的線性梯度遞增的乙腈洗脫，收集對大腸桿菌、銅綠假單細胞菌、肺炎克雷伯氏菌等均有抑菌作用的活性洗脫峰Ⅱ(指色譜圖上出現的第3個峰)，并經旋轉蒸發和冷凍干燥后，得到產品抗菌十二肽。在本專利技術的一種實施方式中，所述磷酸鹽緩沖液為20mmol/L pH7.0。在本專利技術的一種實施方式中，所述Superdux Peptide 10/300GL凝膠色譜分離得到6個洗脫峰。在本專利技術的一種實施方式中，產品使用LC-MS進行鑒定；用Mill-Q水溶解后經LC-MS分離與鑒定；其中流動相為A(乙腈:水:甲酸＝30:970:1(V:V:V))和B(乙腈:水:甲酸＝700:300:1(V:V:V))；洗脫程序如下：0-10min，100％A，0％B；20min，70％A，30％B；30min，0％A，100％B；35min，100％A，0％B；flow rate，1mL/min；柱溫30℃。質譜條件：毛細管電壓3.88kV。圓錐體電壓20V，離子源溫度120℃，去溶溫度300℃，流速1mL/min，分流比50:1。結果用軟件MassLynx 4.1分析。本專利技術的第三個目的是提供所述抗菌肽的應用，是作為飼料添加劑。所述應用，是將抗菌肽與豬溶菌酶或其他溶菌酶聯合使用。本專利技術的第四個目的是提供一種抑制革蘭氏陰性菌的方法，是使用所述的抗菌肽。所述革蘭氏陰性菌，為大腸桿菌、銅綠假單細胞菌、肺炎克雷伯氏菌等。本專利技術的有益效果：(1)本專利技術的抗菌肽SSL-LP屬于堿性肽，與抗菌肽數據庫(The Antimicrobial Peptide Database)等數據庫比對，此種抗菌肽是首次被報道。(2)本專利技術的抗菌肽SSL-LP，對大腸桿菌、銅綠假單細胞菌、肺炎克雷伯氏菌等革蘭氏陰性菌均有明顯抑制作用，是對豬溶菌酶抗菌譜的良好補充和拓展。(3)本專利技術獲得的抗菌肽可作為飼料添加劑與豬溶菌酶或其他溶菌酶聯合使用，有望在將來替代抗生素和解決食品安全問題中發揮重要作用。(4)本專利技術制備工藝具有簡單、快速、高效的特點，所涉及的各種緩沖液配方均可以在實驗手冊中查到，制備得到的產品純度高，經質譜鑒定其純度可達95％以上。附圖說明圖1：十二肽的質譜鑒定圖。具體實施方式實施例1：抗菌十二肽的制備1.溶菌酶產品經重組大腸桿菌BL21(DE3)發酵而來，編碼基因(NCBI-ID:1174173)，通過BamHⅠ和HindⅢ雙酶切之后與載體pET-28a(+)連接，轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達。在25℃、200r/min條件下，利用0.1mmol/L的IPTG誘導8h，離心發酵液獲得菌體。對其進行超聲破碎獲得重組蛋白包涵體，然后對包涵體進行復性，冷凍干燥后最終獲得具有生物活性的豬溶菌酶。發酵產品經胰蛋白酶(15-30mg/g，胰蛋白酶/發酵產品))，于35～38℃水解12～16h，酶解結束后煮沸10分鐘滅酶，酶解液超濾(截留分子量3000Da)濃縮8～10倍，得到粗提液。2.經凝膠過濾色譜Superdux Peptide 10/300GL的分離：將粗提液用緩沖液Ⅱ(磷酸鹽緩沖液，20mmol/L pH7.0)進行透析，經Super本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
【技術特征摘要】
1.一種抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根據權利要求1所述的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽是利用蛋白酶將豬溶菌酶水解，然后經分離純化得到的。3.一種權利要求1所述的抗菌肽的制備方法，其特征在于，所述方法是將豬溶菌酶進行胰蛋白酶水解得到粗提液，然后經凝膠過濾色譜Superdux Peptide 10/300GL和反相柱C18Phenomenex luna分離純化得到抗菌十二肽。4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述豬溶菌酶由重組大腸桿菌發酵而來，發酵上清液經胰蛋白酶，于35～38℃水解12～16h，酶解結束后煮沸滅酶，酶解液超濾濃縮，得到粗提液。5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述分離純化是：(1)將粗提液用磷酸鹽緩沖液透析后，用Superdux Peptide 10/300GL凝膠色譜分離，收集對大腸桿菌、銅綠假單細胞菌、肺炎克雷伯氏...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陸健，蔡國林，朱德偉，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32
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