一種口腔癌特異性檢測的試劑盒制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種用于口腔癌檢測的試劑盒。本發(fā)明專利技術(shù)提供的核酸適體，與人BPIFB2蛋白具有較好的親和能力。利用本發(fā)明專利技術(shù)的核酸適體，可以捕獲唾液中的BPIFB2蛋白，通過其含量的變化來檢測口腔癌，將其制備成為相應(yīng)的試劑盒，將用于口腔癌的篩查。利用本發(fā)明專利技術(shù)的試劑盒，具有高靈敏、成本低的好處。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本申請是申請日為2015年11月15日、申請?zhí)枮?01510775735.6、專利技術(shù)名稱為“一種口腔癌特異性檢測的試劑盒”的專利技術(shù)專利申請的分案申請。
本專利技術(shù)涉及一種用于檢測口腔癌的試劑盒及其檢測方法。
技術(shù)介紹
口腔癌(Oral Squarmous Cell Carcinomas,0SCC)是人體常見的腫瘤之一，尤其是在發(fā)展中國家印度、斯里蘭卡、巴西等其發(fā)病率可以達(dá)到全部腫瘤的25％。近年來口腔癌的發(fā)病率在歐美等發(fā)達(dá)國家有明顯的上升趨勢，特別是發(fā)病年齡趨向年輕化。口腔鱗癌不僅發(fā)病率高，且惡性程度較高；往往造成語音、咀嚼、吞咽、面容等功能障礙和嚴(yán)重的面容毀損，并威脅到患者的生命；五年生存率只有60％左右。盡管近來口腔癌手術(shù)方法的不斷改進(jìn)和放療、化療的廣泛應(yīng)用，但口腔癌的五年生存率并沒有明顯的提高。導(dǎo)致這一狀況的主要原因在于：口腔癌的發(fā)病機(jī)制不清，侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制不明，缺乏有效的早期預(yù)防和預(yù)后判斷手段。因此研究口腔癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，從中找到口腔癌早期預(yù)防、預(yù)后判斷和治療方法是口腔癌研究中急待解決的重大問題。現(xiàn)有技術(shù)已知BPIFB2基因與口腔癌的關(guān)系：BPIFB2與口腔癌具有很好的相關(guān)性，可用于制備口腔癌輔助診斷或者預(yù)后制劑，具有重要的臨床應(yīng)用價值。其中BPIFB2在癌旁組織中的表達(dá)水平明顯低于口腔癌瘤組織和對照質(zhì)粒OOcopies，而在口腔癌組織中的BPIFB2高表達(dá)，即生物信息學(xué)篩選得到的BPIFB2基因與口腔癌具有很好的相關(guān)性，可用于制備口腔癌輔助診斷或者預(yù)后制劑。因此檢測BPIFB2的表達(dá)變得尤為重要。核酸適體(Aptamer,又稱適配體,適配子)是能高親和性、高特異性的結(jié)合某種生物革El標(biāo)的單鏈寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸適體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systemat1c Evolut1on of L1gands by Exponent1al enr1chment,SELEX)從人工合成的DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠高度特異性結(jié)合靶標(biāo)分子的單鏈DNA/RNA。已報(bào)道核酸適體的靶標(biāo)包括金屬離子、有機(jī)小分子、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞甚至組織等。核酸適體的分子識別功能與抗體類似，具有與
抗體分子相當(dāng)甚至更強(qiáng)的靶標(biāo)識別能力，但與抗體相比具有很多優(yōu)良的特性，如分子量小，能批量生產(chǎn)，不易失活，無免疫原性、容易合成與標(biāo)記、快速的穿透組織、良好的代謝動力學(xué)、不同批次之間產(chǎn)品不會存在差異和具有很好化學(xué)穩(wěn)定性，在生物檢測、疾病診斷治療等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種特異結(jié)合BPIFB2的核酸適體及其試劑盒。本專利技術(shù)提供的核酸適體，是序列表的序列1-15所示的單鏈DNA。所述核酸適體與BPIFB2蛋白具有較好的親和能力。還可將所述核酸適體進(jìn)行修飾或改造，得到所述核酸適體的衍生物。所述核酸適體的衍生物可為如下任意一種：a)將所述核酸適體刪除部分或增加部分互補(bǔ)的核苷酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；b)將所述核酸適體進(jìn)行核苷酸取代或部分修飾，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；c)將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；d)將核酸適體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；e)將所述核酸適體連接上熒光、放射性和治療性物質(zhì)后，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物。所述核酸適體可用于制備檢測BPIFB2的試劑盒。利用本專利技術(shù)的核酸適體，可以捕獲中唾液中的中的BPIFB2，從而用于相關(guān)口腔癌篩查。利用本專利技術(shù)的核酸適體，具有高靈敏、成本低、易制備、易保存的優(yōu)點(diǎn)。本專利技術(shù)具有很高的應(yīng)用價值。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本專利技術(shù)，但并不限定本專利技術(shù)。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1 BPIFB2蛋白的獲得將NP_079503所示的BPIFB2基因通過本領(lǐng)域常規(guī)的真核表達(dá)方式進(jìn)行表達(dá)，
獲得了相應(yīng)的目的多肽蛋白。實(shí)施例2核酸適體的篩選和制備設(shè)計(jì)兩端包含大約20個核苷酸、中間包括41個核苷酸的隨機(jī)核酸文庫如下：5‘-ACCTGATGCCATGCATCGCA(N41)CTAGCCAGCCTTTGACATCA-3’；N41代表41個隨機(jī)核苷酸。將單鏈DNA文庫擴(kuò)增為雙鏈DNA,產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以回收的雙鏈DNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA隨機(jī)文庫，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PAGE純化。75μg RNA文庫經(jīng)硝酸纖維素膜反篩去除與膜結(jié)合的RNA分子，然后與2ugBPIFB2蛋白，37℃孵育30min，反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜；然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖液(6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸銨，l.5mmol/L EDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，離心，取上清，無水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴(kuò)增雙鏈DNA，體外轉(zhuǎn)錄出RNA文庫用于下一輪篩選；每輪篩選過程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫，以該雙鏈DNA為模板體外轉(zhuǎn)錄出RNA適配子庫，篩選共進(jìn)行11輪。得到了16個適配子，其序列分別為SEQ ID NO:1-16所示。具體序列如下所示：BPIFB2-1：ACCTGATGCCATGCATCGCATCACACGATCATCACACCGCTCCGCCTTCCAACTACCGCTCCTAGCCAGCCTTTGACATCABPIFB2-2：ACCTGATGCCATGCATCGCACACCTCCACCCTTCGCAACTACCTCTCTTCCTGTAACTATTCTAGCCAGCCTTTGACATCABPIFB2-3：ACCTGATGCCATGCATCGCATCTCATAACAAATCTTCATAATCTTCTATAACACTGTCAATCTAGCCAGCCTTTGACATCABPIFB2-4：ACCTGATGCCATGCATCGCACATCTATATAGAATATATTCAATCCTCTCTCTTATATGCATCTAGCCAGCCTTTGACATCABPIFB2-5：ACCTGATGCCATGCATCGCACTATCAACGACTCTCACGCAACGCTCTTCTTACTACATATA
CTAGCCAGCCTTTGACATCABPIFB2-6：ACCTGATGCCATGCATCGCACCATTCATATCACGAACACCCATTTATACTATATACTACCACTAGCCAGCCTTTGACATCABPIFB2-7：ACCTGATGCCATGCATCGCACGCACTAATATCCTTCATCCCTACTAATAACTCTTTTAACCCTAGCCAGCCTTTGACATCABPIFB2-8：ACCTGATGCCATGCATCGCACACACTCATATTTATACACCAATATCATCTCACTCTATCTCCTAGCCAGCCTTTGACATCABPIFB2-9：ACCTGATGCCATGCATCGCAAACCAAGAATGTCTTACGACATCTCGCCTACTATCCTATATCTAGCCAGCC本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于口腔癌檢測的試劑盒，其含有能特異性與BPIFB2蛋白結(jié)合的核酸適體。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于口腔癌檢測的試劑盒，其含有能特異性與BPIFB2蛋白結(jié)合的核酸適體。2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳博，
申請(專利權(quán))人：陳博，
類型：發(fā)明
國別省市：江西;36