本發明專利技術公開一種用于能夠檢測與區分牛環形泰勒蟲、瑟氏泰勒蟲和中華泰勒蟲的定量PCR檢測引物和探針。本發明專利技術的引物對及探針的基因序列分別為：SEQ?ID?NO.1/SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4/SEQ?ID?NO.5和SEQ?ID?NO.6、SEQ?ID?NO.7/SEQ?ID?NO.8和SEQ?ID?NO.9，并分別在探針的5’端標記了熒光基團FAM、在3’端標記了熒光淬滅基團BHQ1。本申請中建立的檢測牛環形泰勒蟲、瑟氏泰勒蟲和中華泰勒蟲的定量PCR方法能夠很好補充顯微鏡檢測的缺點，方便的檢測區分這三種泰勒蟲，具有靈敏度高、特異性強的優點，并能夠定量的檢測感染寄生蟲DNA。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種鑒別動物寄生蟲的檢測試劑盒，確切地講本專利技術提供一種可區分并鑒別三種牛泰勒蟲DNA的試劑盒，以及應用這種試劑盒的具體操作方法。
技術介紹
牛泰勒蟲病(Theileriosis)是由頂復門、梨形蟲綱、泰勒科(Theileridae)、泰勒屬(Theileria)的原蟲感染牛引起的一種蜱傳性血液原蟲病的總稱，該病以發熱、貧血、黃疸及體表淋巴結腫大為典型癥狀(許應天,張守發,李順玉,金明虎.牛泰勒蟲病的診斷及預防研究進展[J].延邊大學農學學報,1997,04:271-275.)。此類疫病的傳播媒介均是蜱，具有明顯的季節性和地方性，多以地方流行為主，很難徹底清除和消滅，因而給養殖業帶來巨大經濟損失和潛在威脅。在我國已報道感染牛的泰勒蟲有環形泰勒蟲、中華泰勒蟲(T.sinensis)和瑟氏泰勒蟲(T.sergenti)三種。其中環形泰勒蟲致病力最強，其主要傳播媒介為殘緣璃眼蜱和小亞璃眼蜱，這兩種蜱在我國均存在；牛感染環形泰勒蟲后多以急性發病為主，死亡率較高，造成嚴重的經濟損失，被認為是惡性泰勒蟲(Morrison WI,McKeever DJ.Current status of vaccine development against Theileria parasites.Parasitology 2006；133Suppl:S169-87.)。瑟氏泰勒蟲雖然致病力相對較弱，但分布較為廣泛(Liu A,Guan G,Liu Z,Liu J,Leblanc N,Li Y,et al.Detecting and differentiating Theileria sergenti and Theileria sinensis in cattle and yaks by PCR based on major piroplasm surface protein(MPSP).Experimental parasitology 2010；126:476-81.)，其傳播媒介主要是長角血蜱；瑟氏泰勒蟲感染牛后引起嚴重貧血、異常消瘦。另外水牛泰勒蟲(T.buffeli)、東方泰勒蟲(T.orientalis)與瑟氏泰勒蟲在進化關系上十分接近，目前學者統稱為溫和型泰勒蟲(Gubbels MJ,Hong Y,van der Weide M,Qi B,Nijman IJ,Guangyuan L,et al.Molecular characterisation of the Theileria buffeli/orientalis group.International journal for parasitology 2000；30:943-52.；Stewart NP,Uilenberg G,de Vos AJ.Review of Australian species of Theileria,with special reference to Theileria buffeli of cattle.Tropical animal health and production 1996；28:81-90.)。據報道中華泰勒蟲目前僅發現于甘肅省境內，而青海血蜱若蜱以及日本血蜱成蜱具有傳播中華泰勒蟲的能力(殷宏,劉光遠,李有全,白啟,馬少祥,李世恩.中華泰勒蟲(Theileria sinensis)媒介蜱的確定[A].中國畜牧獸醫學會家畜寄生蟲學分會.中國畜牧獸醫學會家畜寄生蟲學分會第五次代表大會暨第八次學術研討會論文集[C].中國畜牧獸醫學會家畜寄生蟲學分會:,2004:1.)。雖然前述的感染牛的三種泰勒蟲在其生物學特性上差異較大，但是所引起疾病在發病初期具有相似的臨床癥狀，即發熱、厭食、黃疸和貧血，根據臨床癥狀很難確定具體的其感染病原，容易錯過了此類疾病早期防控與治療的最佳時期。目前診斷牛泰勒蟲病一般的方法為血涂片染色檢測法和淋巴結穿刺檢測法。血涂片法以采取少量牛耳尖血制備成血涂片，經甲醇固定和吉姆薩染色后在顯微鏡下觀察紅細胞內特有的蟲體形態進行確診，但是這需要經驗豐富、操作熟練的專業人員，而且一般情況下感染率很低或在感染早期鏡檢很難發現蟲體。淋巴結穿刺是一般用潔凈的針頭刺入淋巴結，抽取內容物并進行涂片染色觀察，若涂片中發現裂殖體即可確診，但泰勒蟲寄生于淋巴結中裂殖體持續時間較短，所以這種方法具有一定的時限性，只能作為輔助性的臨床診斷方法。目前雖有一些血清學診斷方法的報道，如補體結合檢驗、間接免疫熒光抗體、酶聯免疫吸附檢驗，但是均存在抗原制備或來源不足、敏感性低和特異性不好(假陽性或假陰性及交叉反應)等問題，因而限制了其推廣與應用。分子生物 學診斷方法有常規PCR(Liu A,Guan G,Liu Z,Liu J,Leblanc N,Li Y,et al.Detecting and differentiating Theileria sergenti and Theileria sinensis in cattle and yaks by PCR based on major piroplasm surface protein(MPSP).Experimental parasitology 2010；126:476-81.；殷宏，等，一種用于區分牛泰勒蟲的試劑盒及檢測方法，專利申請號:200910126259X)、反向線性印跡雜交(RLB)檢測技術(Niu Q,Luo J,Guan G,Ma M,Liu Z,Liu A,et al.Detection and differentiation of ovine Theileria and Babesia by reverse line blotting in China.Parasitology research2009；104:1417-23.)，但存在操作流程相對繁瑣耗時、診斷周期較長的缺點；而檢測泰勒蟲的環介導等溫擴增技術(LAMP)也有報道(Liu Z,Hou J,Bakheit MA,Salih DA,Luo J,Yin H,et al.Development of loop-mediated isothermal amplification(LAMP)assay for rapid diagnosis of ovine theileriosis in China.Parasitology research 2008；103:1407-12.)，但由于技術性缺陷(如氣溶膠污染等)導致容易出現假陽性的問題。由于實時熒光定量PCR診斷法具有靈敏度高、特異性強、無復雜的后續處理過程，高效、快捷的特點，近年來被越來越多的應用于病原體的檢測，例如蔣春燕,王泰健,王琴,范學政.實時熒光定量PCR技術[J].動物醫學進展,2005,12:97-101.。目前已報道的鑒別環形泰勒蟲實時熒光定量PCR方法均是以裂殖子表面抗原(Tams 1)為靶基因，如《牛環形泰勒蟲病實時熒光PCR診斷方法的建立及初步應用》([J].中國獸醫學報,2013,09:1369-1372，郭慶勇,王振寶,何曉杰,曹雯麗,巴音查汗.；和Kundave VR,Patel AK,Pate本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用于區分鑒別感染不同種牛泰勒蟲的試劑盒，其特征是檢測試劑盒中至少含有SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.4和SEQ?ID?NO.5、SEQ?ID?NO.7和SEQ?ID?NO.8三對引物和SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.6和SEQ?ID?NO9三條分別在5’端標記了熒光基團FAM、在3’端標記了熒光淬滅基團BHQ1的標記探針。
【技術特征摘要】
1.一種用于區分鑒別感染不同種牛泰勒蟲的試劑盒，其特征是檢測試劑盒中至少含有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8三對引物和SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO9三條分別在5’端標記了熒光基團FAM、在3’端標記了熒光淬滅基團BHQ1的標記探針。2.權利要求1所述的一種用于區分鑒別感染不同種牛泰勒蟲的試劑盒，其特征是試劑盒內還分別放置有含分別...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉軍龍，謝俊仁，劉娟，關貴全，劉愛紅，李有全，羅建勛，殷宏，劉光遠，
申請(專利權)人：中國農業科學院蘭州獸醫研究所，
類型：發明
國別省市：甘肅;62
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