本發明專利技術涉及一種核酸檢測技術，具體而言是一種依賴內切酶結合側向層析的核酸等溫檢測技術和試劑。本發明專利技術所使用的雙標記探針DNA分子在沒有和目的核酸片段結合時，保持一種二級結構，沒有特定的核酸內切酶的切點。而當雙標記探針DNA分子能夠和目的片段結合后，可改變二級結構，能夠被特定DNA內切酶識別并切開。雙標記探針DNA分子能夠被對應的側向層析試紙檢測，內切酶切開的雙標記探針DNA分子的片段則不能被檢測。該方法具有識別序列較短，對引物位置要求較低，檢測效率較高，DNA和RNA均能直接檢測等特點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種核酸檢測技術，具體而言是一種依賴內切酶結合側向層析的核酸等溫檢測技術和試劑。背景知識核酸等溫檢測技術是核酸體外檢測技術的一種，其反應過程始終維持在恒定的溫度下，通過添加等溫擴增DNA聚合酶和各自特異性引物以及其他輔助酶類或報告基團來達到快速核酸擴增的目的。由于等溫擴增的產物結構復雜，一般不適合用于分子克隆，主要用于核酸體外診斷。核酸等溫擴增技術由于不需要使用PCR儀等專用設備，因此適合在基層醫院和簡易實驗室中推廣使用，因此近幾年發展迅速。常見的等溫擴增技術主要包括：環介導核酸等溫擴增技術(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)、滾環擴增技術(Rolling Circle Amplification，RCA)、單引物等溫擴增技術(Single Primer Isothermal Amplification，SPIA)、依賴解旋酶恒溫擴增技術(Helicase-dependent Isothermal DNA Amplification，HDA)、依賴核酸序列的擴增(Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA)、鏈替代擴增(Strand Displacement Amplification，SDA)、快速等溫檢測放大技術(Rapid Isothermal Detection and Amplification，RIDA)、交叉引物等溫擴增(Cross priming amplification，CPA)等。上述方法可以分為三大類，第一類以RCA為代表的多步反應等溫擴增檢測方法，包括RCA、SPIA等。該類方法的特點是在反應過程中先通過一步反應合成檢測中間體，而后對其進行等溫擴增，實現核酸檢測。以RCA為例，該技術是于1998年模擬自然界微生物環狀DNA的滾環復制過程，發展起來的一種放大信號和靶核酸相結合的檢測方法。先根據引物特異性，合成DNA環，作為等溫擴增中間體，而后在具有鏈置換活性的DNA聚合酶作用下由一條引物與環形DNA模板的鏈置換合成，實現環狀DNA模板的體外等溫線性擴增。依據擴增過程中加入的引物不同可分為線性擴增、指數擴增、多引物擴增和信號擴增等。該類檢測方法的缺點在于，需要多步反應才能得到檢測結果，檢測方法繁瑣，費用較高，也較為費時，檢測靈敏度也較低。第二類，以LAMP為代表的多引物依賴于鏈置換酶活性的等溫擴增檢測技術，該類技術主要包括LAMP、CPA等。上述技術的核心是通過巧妙的引物設計，不需要使用連接酶等輔助酶直接通過擴增產生等溫擴增中間體。進而依靠引物組擴增中間體上的特定片段，通過檢測擴增產物實現核酸檢測。以LAMP為例，該方法針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用BstDNA聚合酶在等溫條件下擴增出雙發卡狀中間體，進而進入循環實現鏈增長，最終的產物為不同級數的擴增產物的混合物。反應產物可通過電泳或者根據擴增副產物焦磷酸鎂沉淀形成的濁度或者熒光染料進行判斷。此類方法具有快速、高靈敏度的特點但是由于氣溶膠污染的原因，該類方法的假陽性結果較多，另外在進行引物設計時，要求目的片段在300bp之內具有150bp左右的保守序列，引物設計繁瑣，而且在高突變率的RNA病毒基因組中，這樣的序列是很難找到的，粗放的引物設計容易導致假陰性，這極大地限制了該方法的應用。第三類，以RIDA為代表的不進行擴增的核酸檢測技術。該類方法不依靠核酸擴增產生檢測信號，而通過分子燈標的方法進行檢測。以RIDA為例，該方法通過核酸切刻酶的活性，將和檢測目的序列結合的分子燈標切開，產生熒光信號進行檢測。該類方法由于核酸切刻酶種類有限，因此對目的序列限制較大。而且只能切刻DNA雙鏈，不能直接檢測RNA，因而并沒有得到廣泛的應用。總之，核酸等溫擴增技術在檢驗醫學中體現出的最大的優勢在于操作簡單，檢測時間較短，不需要依賴大型設備等幾個方面。而目前的等溫檢測方法依然存在著一些缺欠，第一類技術方法由于需要在體系中加入連接酶、解旋酶等物質，需要多步反應完成，無法體現出操作簡便的優勢。第二類方法則對目的片段的保守性要求過高，引物設計復雜，容易引起氣溶膠污染，其應用也受到了一定的限制。第三類方法還處于發展初期，RIDA方法需要切刻酶參與對檢測目的序列提出了更高的要求，也沒有得到廣泛的應用。綜上所述，建立一種具有識別序列較短(類似于PCR反應識別2段特異性序列)，對引物位置要求較低，檢測體系簡單(一步完成)，檢測效率較高，檢測目的核酸通用性強(DNA和RNA均能直接檢測)等特點的核酸等溫檢測技術，對有效的拓展核酸等溫擴增技術的應用范圍具有重要的作用。特別是近年來即時檢測技術(POCT，point-of-care testing)發展迅速， 本專利技術所開發的一種依賴內切酶結合側向層析的核酸等溫檢測技術和試劑，可以不依賴熒光PCR儀等大型設備進行檢測。能夠采樣現場即刻進行分析，省去標本在實驗室檢驗時的復雜處理程序，從而快速得到檢驗結果的一種核酸檢測方法，具有重要的臨床意義。
技術實現思路
本專利技術的目的：本專利技術旨在建立一種依賴于內切酶活性的核酸檢測技術具有識別序列較短(類似于PCR反應識別2段特異性序列)，對引物位置要求較低，檢測體系簡單(一步完成)，檢測效率較高，檢測目的核酸通用性強(DNA和RNA均能直接檢測)僅使用一個恒溫裝置既可以完成的依賴內切酶結合側向層析的核酸等溫檢測技術和試劑。本專利技術的技術原理：DNA單鏈分子在水溶液中會根據其一級結構，折疊成特定的二級結構。決定二級結構形態的因素在于DNA分子內、DNA分子間或者DNA和RNA分子間能夠形成堿基互補配對。因此當一種特定的DNA分子在溶液中時，它會保持一種二級結構；而當另一種能夠和該DNA分子形成堿基互補配對雙鍵的核酸分子加入到該溶液中時，能夠改變第一種DNA分子的二級結構。本專利技術即是通過DNA分子的該特點設計的。本研究進行核酸檢測使用的是DNA分子探針，該探針DNA分子在沒有和目的核酸片段結合時，保持一種二級結構(如圖一所示)，此時在該結構上沒有特定的核酸內切酶的切點。而當有目的核酸片段存在時，探針DNA分子能夠和目的片段結合改變其二級結構，此時形成了具有三段雙鏈結構的“丫”字型的核酸分子(如圖二所示)，其中兩條雙鏈為探針和目的核酸分子之間形成的，而另一條雙鏈則為探針DNA分子自己折疊形成的。在這條分子內折疊形成的雙鏈上，具有能夠被特定DNA內切酶識別的識別位點和能夠被該內切酶切開的酶切位點。當溶液中存在該內切酶時，探針DNA分子能夠被內切酶切開。由于熱力學的作用，新的未被切開的探針DNA分子將替代被切開的分子和目的片段結合。該循環周而往復，溶液中的探針DNA分子不斷被切開，切開的探針分子和未被切開的探針分子能夠通過瓊脂糖凝 膠電泳進行區別分析，實現目的核酸片段的等溫檢測。當在探針DNA分子上進行熒光標記后，還能夠通過熒光檢測裝置檢測出被切開的DNA分子，實現目的核酸片段的熒光等溫檢測。本專利技術是通過以下技術方案實現的：1.探針DNA分子的設計 本研究使用的探針DNA分子，需要至少具備以下功能，探針DNA分子在沒有和目的核酸片段結合時，保持一種二級結構，此時本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種依賴內切酶結合側向層析的核酸等溫檢測技術和試劑，其特征在于這種依賴核酸內切酶活性的核酸等溫檢測技術使用一種特殊的探針DNA分子，該探針DNA分子在沒有和目的核酸片段結合時，在溶液中保持一種二級結構，此時在該結構上沒有特定的核酸內切酶的切點。
【技術特征摘要】
1.一種依賴內切酶結合側向層析的核酸等溫檢測技術和試劑，其特征在于這種依賴核酸內切酶活性的核酸等溫檢測技術使用一種特殊的探針DNA分子，該探針DNA分子在沒有和目的核酸片段結合時，在溶液中保持一種二級結構，此時在該結構上沒有特定的核酸內切酶的切點。2.根據權利要求1所述的一種依賴內切酶結合側向層析的核酸等溫檢測技術和試劑，其特征在于，這種依賴核酸內切酶活性的核酸等溫檢測技術使用一種特殊的探針DNA分子，當有目的核酸片段存在時，探針DNA分子能夠識別目的片段上的特異性序列和其互補配對形成雙鏈結構從而改變探針DNA分子的二級結構，此時形成了至少具有三段雙鏈結構的的核酸分子，且其中兩條雙鏈為探針和目的核酸分子之間形成的，而另一條雙鏈則為探針DNA分子自己折疊形成的，這條探針DNA分子自己折疊形成的分子內雙鏈上，具有能夠被特定DNA內切酶識別的識別位點和能夠被該內切酶切開的酶切位點，形成檢測中間體。3.根據權利要求1所述的一種依賴內切酶結合側向層析的核酸等溫檢測技術和試劑，其特征在于使用能夠識別檢測中間體上由探針DNA分子自己折疊形成的分子內雙鏈上的識別位點的內切酶，在該雙鏈上的酶切位點位置切開探針DNA分子。4.根據權利要求1所述的一種依賴內切酶結合側向層析的核酸等溫檢測技術和試劑，其特征在于被核酸內切酶切開的探針DNA分子能夠在適合的溫度下，即50℃至60℃之間從待測的核酸片段上解離下來，而待測片段重新和另一個探針DNA分子結合，開始一個新的結合-重構-酶切-解離的過程。檢測解離下來的探針DNA分子片段，作為目的核酸存在的依據。5.根據權利要求1所述的一種依賴內切酶結合側向層析的核酸等溫檢測技術和試劑，其特征在于該技術即可以用于檢測DNA分子也可以用于檢測RNA分子，即和探針DNA分子結合 的目的核酸片段即可以是DNA分子也可以是RNA分子。6.一種依賴內切酶結合側向層析的核酸等溫檢測試劑，其特征在于，合成探針DNA分子，分別在該探針DNA分子的5’端和3’端標記不同的抗原基團，如生物素、熒光素或者其他具有抗原性的基團如地高辛等，形成雙標記探針。7.根據權利要求6所述...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉寅，祁軍，
申請(專利權)人：南開大學，
類型：發明
國別省市：天津;12
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