一種谷氨酸棒桿菌及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種谷氨酸棒桿菌及其應用，屬于微生物領域。所述谷氨酸棒桿菌于2016年6月1日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO:M?2016303。該谷氨酸棒桿菌可在細胞內積累較多的丙酰輔酶A，較ATCC13869提高了15.8倍，可用于以丙酰輔酶A為底物的相關代謝產物的生產。當引入聚羥基脂肪酸酯合成基因后，該谷氨酸棒桿菌可以合成PHBV，但在ATCC13869中合成產物為PHB。該發明專利技術解決了外源添加丙酸鹽或丙酸來生產PHBV的現狀，實現了在谷氨酸棒桿菌中無外源添加丙酸或丙酸鹽直接生產PHBV，降低了生產成本。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種谷氨酸棒桿菌及其應用，屬于微生物領域。
技術介紹
近年來，聚羥基脂肪酸酯作為一種石化衍生塑料的潛在替代物，越來越受到科學界和商業界的關注，其可以通過微生物胞內積累獲得。目前，利用細菌實現產業化的主要有PHB、PHBV等，PHBV較PHB的材料性能改進很多，有更高的附加值。PHB的合成需要細胞代謝提供乙酰輔酶A，而PHBV的合成同時還需要大量的丙酰輔酶A。一般的菌株胞內積累較少的丙酰輔酶A，不足以合成PHBV，需要添加丙酸才能合成PHBV，這大大增加了生產成本。目前，常用于合成聚羥基脂肪酸酯的微生物主要有假單胞菌、大腸桿菌和嗜鹽古菌等，但這些微生物在生產上都有一定的局限性，如假單胞菌和大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，膜壁上內毒素、附屬結構等，具有一定的安全隱患，而嗜鹽古菌對發酵器材的腐蝕也是一大問題。因此谷氨酸棒桿菌，作為一種常用于各種氨基酸生產的食品安全菌具有很大的應用潛力，且發酵的菌濃可以很高，最終OD562可以達到80以上。目前，有報道谷氨酸棒桿菌應用于PHB的合成，也有報道添加丙酸鹽后可以合成PHBV。然而，目前用于合成PHB或者PHBV的谷氨酸棒桿菌，胞內多積累乙酰輔酶A，僅積累少量的丙酰輔酶A，這對于利用丙酰輔酶A的代謝產物的合成有很大的限制作用。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一株可在胞內過量積累丙酰輔酶A的谷氨酸棒桿菌，已于2016年6月1日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M 2016303，保藏地址為中國武漢武漢大學。可應用于利用丙酰輔酶A代謝合成產物的生產。同時如其他谷氨酸棒桿菌一樣也可以積累乙酰輔酶A。該谷氨酸棒桿菌為食品安全菌，且在發酵培養條件下，最終OD562高達110以上。本專利技術菌株與報道的谷氨酸棒桿菌ATCC13869相比，具有胞內過量積累丙酰輔酶A的特性，較ATCC13869提高了15.8倍。當外源引入聚羥基脂肪酸酯合成基因phaCAB，在無外源添加丙酸鹽的條件下可以合成PHBV，且HV的比例高達58％。谷氨酸棒桿菌WM001菌株在生產PHBV方面有突出優勢，具有廣闊的應用前景。生物材料保藏谷氨酸棒桿菌WM001(Corynebacterium glutamicum WM001)，已于2016年6月1日保
藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M 2016303，保藏地址為中國武漢武漢大學。附圖說明圖1細胞胞內丙酰輔酶A和乙酰輔酶A的含量測定圖2甲酯化的氣相色譜分析圖A商品化PHBB商品化PHBVC ATCC13869/pDXW-8-phaCAB中積累的PHBD ATCC13869/pDXW-8對照E WM001/pDXW-8-phaCAB中積累的PHBVF WM001/pDXW-8對照具體實施方式在下面的實施例中，所用的不同培養基配方如下：種子培養基配方為(g/100mL)：玉米漿1.5，硫酸銨3.5，硫酸鎂0.05，磷酸二氫鉀0.1，葡萄糖13，碳酸鈣2，pH為7.2.；種子培養基配方為(g/100mL)：玉米漿3，硫酸二銨0.5，硫酸鎂0.05，磷酸二氫鉀0.1，葡萄糖3，pH為7.2。發酵培養基配方為(g/100mL)：玉米漿1.5，硫酸銨3.5，硫酸鎂0.05，磷酸二氫鉀0.1，葡萄糖13，碳酸鈣2，pH為7.2.；種子培養基配方為(g/100mL)：玉米漿3，硫酸二銨0.5，硫酸鎂0.05，磷酸二氫鉀0.1，葡萄糖3，pH為7.2。實施例1菌株的鑒定谷氨酸棒桿菌分離自無錫垃圾填埋廠，該菌株在LBG培養基上生長良好，LBG培養基組成為1％蛋白胨，0.5％酵母粉，0.5％NaCl，pH 7.0～7.2。菌落呈圓形，米黃色，邊緣整齊。將該谷氨酸棒桿菌菌株的16S rDNA基因序列與NCBI中細菌16S rDNA基因序列進行同源比對，發現該菌株與已報道的谷氨酸棒桿菌ATCC13869的相似性最近。將該菌于2016年6月1日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M 2016303。實施例2本專利技術菌株CCTCC NO：M 2016303的胞內丙酰輔酶A和乙酰輔酶A的提取及測定1.菌體培養采用種子培養基培養18h后，按照1％接種量轉接至發酵培養基中，培養24h后，取發酵樣品；2.胞內丙酰輔酶A和乙酰輔酶A的提取取對數中期發酵液1mL，10,000rpm,0oC條件下離心30s收集細胞，利用冰的0.9％的生理鹽水洗滌菌體2次，用1mL溶液I(甲醇：乙腈：水＝45:45:10，v/v/v)重懸細胞，并加0.1M的甲酸猝滅；然后對猝滅的菌懸液在0oC條件下超聲破碎5min，離心去除細胞碎片等沉淀，過濾上清獲得丙酰輔酶A和乙酰輔酶A提取液，以備液質聯用測定。3.丙酰輔酶A及乙酰輔酶A標準樣品的標準曲線測定丙酰輔酶A和乙酰輔酶A標準樣品購自Sigma公司，并按照一定濃度梯度配制丙酰輔酶A標準樣品，乙酰輔酶A標準樣品。4.胞內丙酰輔酶A和乙酰輔酶A的測定將上述步驟2和3中制備好的樣品丙酰輔酶A和乙酰輔酶A溶液立即用于儀器TSQ Quantum Ultra(Thermo Scientific,San Jose,CA,USA)液質聯用測定，采用C18柱子測定，A相為5mM的乙酸銨水溶液，B相為100％甲醇，流速為0.4mL/min，提取丙酰輔酶A和乙酰輔酶A的離子峰，丙酰輔酶A母離子m/z＝824,其碎片m/z＝317，乙酰輔酶A母離子m/z＝810,其碎片m/z＝303。根據標樣標準曲線計算發酵液樣品的胞內丙酰輔酶A和乙酰輔酶A含量。具體含量見圖1所示，CCTCC NO：M 2016303的胞內丙酰輔酶A含量較谷氨酸棒桿菌ATCC13869提高15.8倍。對照實施例2ATCC13869菌株的胞內丙酰輔酶A和乙酰輔酶A的提取及測定1.同實施例2；具體含量見圖1所示。2.取與實施例2中WM001同樣的生物量提取，提取過程同實施例2中2；3.胞內丙酰輔酶A和乙酰輔酶A含量測定，同實施例2中4。實施例3本專利技術菌株在PHBV合成方面的應用1.重組工程菌WM001/pDXW-8-phaCAB的構建(1)以羅氏真養菌基因組NC_008313.1為模板，采用引物phaCAB-F/phaCAB-R擴增phaCAB基因簇，擴增phaCAB基因簇的引物phaCAB-F/phaCAB-R序列為phaCAB-F：5’-CTGGAATTCAGAAGGAGAATCAAATCATGGCGACCGG-3’phaCAB-R：5’-CCGCTCGAGAGGTCAGCCCATATGCAGG-3’(2)用限制性內切酶EcoRI和XhoI消化PCR產物，載體pDXW-8(載體pDXW-8的構建方法參見申請號為200910233618.1，專利技術名稱為一種大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭型誘導表達載體pDXW-8及其構建方法的專利申請)用EcoRI和XhoI消化處理，酶切產物純化后，使用T4連接酶22℃過夜處理，轉化至大腸桿菌DH5α，篩選正確轉化子，對于得到的正確轉化子，
提取質粒后用1.8kV，5ms電轉化入谷氨酸棒桿菌WM001感受態，再次篩選正確的基因工程重組菌WM001/pDXW-8-phaCA本文檔來自技高網...

【技術保護點】
谷氨酸棒桿菌WM001(Corynebacterium?glutamicum?WM001)，已于2016年6月1日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M?2016303，保藏地址為中國武漢武漢大學。

【技術特征摘要】
1.谷氨酸棒桿菌WM001(Corynebacterium glutamicum WM001)，已于2016年6月1日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M 2016303，保藏地址為中國武漢武漢大學。2.權利要求1所述谷氨酸棒桿菌WM001在生...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王小元，馬文漸，王建莉，李燁，王甜憶，林琳，孫康康，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32