本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種高產(chǎn)L?賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌的構(gòu)建方法。該方法將谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium?glutamicum)的NCgl1221基因失活后構(gòu)建獲得，NCgl1221基因編碼框的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明專利技術(shù)提供一種高產(chǎn)L?賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌菌株的構(gòu)建方法，構(gòu)建的該菌株由于內(nèi)源基因NCgl1221失活引起谷氨酸胞外分泌量明顯降低，與野生型相比，該菌株可生產(chǎn)高濃度的L?賴氨酸，并能有效降低發(fā)酵液副產(chǎn)物谷氨酸的含量，作為L(zhǎng)?賴氨酸生產(chǎn)菌株能夠進(jìn)一步降低生產(chǎn)和純化成本。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種高產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌的構(gòu)建方法，屬于生物技術(shù)
技術(shù)介紹
L-賴氨酸屬于天冬氨酸家族氨基酸，是人和動(dòng)物體八大必須氨基酸之一。L-賴氨酸具有多種生理功能，如具備平衡氨基酸組成、調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝平衡、提高機(jī)體對(duì)谷類蛋白質(zhì)的吸收及利用率和促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育等，因而被廣泛應(yīng)用于飼料、食品及醫(yī)藥行業(yè)中。由于市場(chǎng)需求旺盛，L-賴氨酸目前已成為僅次于谷氨酸的第二大氨基酸品種，年產(chǎn)量約350萬噸。工業(yè)上生產(chǎn)L-賴氨酸的方法主要有三種，即蛋白水解法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。其中微生物發(fā)酵法由于具有低成本、高產(chǎn)率、低污染等優(yōu)勢(shì)成為目前L-賴氨酸生產(chǎn)的主流方法。目前可用于L-賴氨酸生產(chǎn)的微生物主要為細(xì)菌，包括棒狀桿菌、短桿菌、念球菌、假單胞菌、芽孢桿菌、埃希氏菌等，其中以屬于棒狀桿菌屬的谷氨酸棒狀桿菌目前應(yīng)用最為廣泛。雖然自然界微生物能夠直接發(fā)酵產(chǎn)生L-賴氨酸，但產(chǎn)量通常較低，因此需要對(duì)微生物進(jìn)行改造。如中國(guó)專利技術(shù)專利CN1539015公開了包括accBC、accDA、catA、cysD、cysE在內(nèi)的多個(gè)可用于賴氨酸產(chǎn)量提高的基因改進(jìn)位點(diǎn)。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN101600796(申請(qǐng)?zhí)?00780048626.8)、CN1974760(申請(qǐng)?zhí)?00610163142.5)、CN103243042(申請(qǐng)?zhí)?01310092638.8)分別對(duì)基因NCg22534、NCgl1835、NCg21090進(jìn)行失活獲得一系列L-賴氨酸產(chǎn)率提高的谷氨酸棒狀桿菌工程菌。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌的構(gòu)建方法。本專利技術(shù)通過改造菌株谷氨酸棒狀桿菌獲得，具體策略為失活谷氨酸棒狀桿菌內(nèi)源基因NCgl1221(編碼谷氨酸胞外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)以降低賴氨酸發(fā)酵過程中谷氨酸的胞外分泌，減少L-賴氨酸發(fā)酵時(shí)發(fā)酵液中副產(chǎn)物谷氨酸的含量，使更多的碳流量流向L-賴氨酸合成方向，提高L-賴氨酸發(fā)酵底物利用率，便于純化。術(shù)語說明本專利技術(shù)中，“失活”可以通過本領(lǐng)域已知的任何失活方法來誘導(dǎo)。“失活”產(chǎn)生的效果是指內(nèi)源基因NCgl1221的表達(dá)被降低到很低的水平，或者產(chǎn)生不表達(dá)基因以及盡管被表達(dá)但表達(dá)不具有活性或活性降低的產(chǎn)物。本專利技術(shù)中，“失活”可以通過基因工程手段在內(nèi)源基因NCgl1221中插入一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)，或者缺失該內(nèi)源基因NCgl1221中的一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)，或者由基因內(nèi)部序列轉(zhuǎn)換或顛換獲得。本專利技術(shù)技術(shù)方案如下：一種高產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌，是將谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)的NCgl1221基因失活后構(gòu)建獲得，NCgl1221基因編碼框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。根據(jù)本專利技術(shù)優(yōu)選的，所述谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)來源于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種編號(hào)CICC 23604。根據(jù)本專利技術(shù)優(yōu)選的，上述構(gòu)建方法，步驟如下：(1)通過PCR擴(kuò)增NCg l1221基因編碼框內(nèi)一段長(zhǎng)度大于400bp的基因片段作為同源臂序列，NCgl1221基因編碼框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)通過PCR擴(kuò)增抗性標(biāo)簽基因片段；(3)將步驟(1)制得的同源臂序列與步驟(2)制得的抗性標(biāo)簽基因片段進(jìn)行重疊PCR進(jìn)行連接，制得融合片段的兩末端均含有相同的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，并且該酶切位點(diǎn)不能出現(xiàn)在擬敲除基因和抗性標(biāo)簽基因中；(4)制備谷氨酸棒狀桿菌感受態(tài)細(xì)胞，將步驟(3)制得的融合基因經(jīng)酶切后轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌感受態(tài)細(xì)胞，即得。根據(jù)本專利技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(1)中，PCR擴(kuò)增以谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)的基因組DNA為模板，獲得同源臂NCg1，PCR擴(kuò)增引物的核苷酸序列如下：F1:CGGGATCCCGTTTTTCATGCTTGCCGTCT；R1:AAGGCCAGCAAAA GCTAAAGCCCAAGAATGCAAC；PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下，總體系為50μl：PCR擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。根據(jù)本專利技術(shù)優(yōu)選的，所述步驟(2)中，PCR擴(kuò)增模板為穿梭質(zhì)粒pHT01(購自杭州寶賽生物科技有限公司)的DNA，獲得氯霉素抗性基因Cmr；PCR擴(kuò)增引物的核苷酸序列如下：F2:GGTGGTCGGCATTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA；R2:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT；PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下，總體系為50μl：所述的PCR擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。根據(jù)本專利技術(shù)優(yōu)選的，所述步驟(3)中，重疊PCR的第一階段擴(kuò)增體系如下，總體系為25μl：重疊PCR的第一階段擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min，5個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；重疊PCR的第二階段擴(kuò)增體系為在第一階段擴(kuò)增后的產(chǎn)物基礎(chǔ)上加入如下成分，總體系為50μl：重疊PCR的第二階段擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸4min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。根據(jù)本專利技術(shù)優(yōu)選的，所述步驟(4)的具體步驟如下：(i)挑取谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)單菌落，在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌體濃度OD600為0.7～0.9，置于冰上冷卻，冷卻后離心，用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液洗滌菌體3～5次，電轉(zhuǎn)緩沖液重懸菌體，制得感受態(tài)細(xì)胞；(ii)對(duì)步驟(3)制得的融合基因進(jìn)行單酶切，28～32℃酶切2～5h，高壓電擊轉(zhuǎn)化至步驟(i)制得的感受態(tài)細(xì)胞中，移入液體復(fù)蘇培養(yǎng)基，在28～32℃培養(yǎng)3～4h后，篩選，即得。根據(jù)本專利技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(ii)中單酶切體系如下，總體系為40μl：根據(jù)本專利技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(i)中，種子培養(yǎng)基，每升組分如下：蛋白胨8～12g、酵母粉4～6g、氯化鈉8～12g、山梨醇85～96g。根據(jù)本專利技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(i)中，電轉(zhuǎn)緩沖液，每升組分如下：山梨醇85～96g、甘露醇85～96g、甘油95～105mL。根據(jù)本專利技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(i)中，高壓電擊轉(zhuǎn)化的條件為：2100V電擊5ms。根據(jù)本專利技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(ii)中液體復(fù)蘇培養(yǎng)基，每升組分如下：蛋白胨8～12g、酵母粉4～6g、氯化鈉8～12g、山梨醇85～96g、甘露醇65～73g。上述構(gòu)建方法制得的高產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌在生產(chǎn)L-賴氨酸中的應(yīng)用。構(gòu)建原理谷氨酸胞外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)谷氨酸的胞外分泌，但在高產(chǎn)L-賴氨酸菌種中，專利技術(shù)人通過研究發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)則會(huì)造成L-賴氨酸發(fā)酵時(shí)發(fā)酵液中副產(chǎn)物谷氨酸的含量的增加，導(dǎo)致碳流量流向L-賴氨酸合成方向減少，進(jìn)而影響包括賴氨酸的合成在內(nèi)的細(xì)胞其它代謝過程。因此，通過構(gòu)建NCgl1221基因失活，從而達(dá)到獲得L-賴氨酸高本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種高產(chǎn)L?賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌，其特征在于，將谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium?glutamicum)的NCgl1221基因失活后構(gòu)建獲得，NCgl1221基因編碼框的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種高產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌，其特征在于，將谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)的NCgl1221基因失活后構(gòu)建獲得，NCgl1221基因編碼框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)來源于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種編號(hào)CICC 23604。3.如權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下：(1)通過PCR擴(kuò)增NCg l1221基因編碼框內(nèi)一段長(zhǎng)度大于400bp的基因片段作為同源臂序列，NCgl1221基因編碼框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)通過PCR擴(kuò)增抗性標(biāo)簽基因片段；(3)將步驟(1)制得的同源臂序列與步驟(2)制得的抗性標(biāo)簽基因片段進(jìn)行重疊PCR進(jìn)行連接，制得融合片段的兩末端均含有相同的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，并且該酶切位點(diǎn)不能出現(xiàn)在擬敲除基因和抗性標(biāo)簽基因中；(4)制備谷氨酸棒狀桿菌感受態(tài)細(xì)胞，將步驟(3)制得的融合基因經(jīng)酶切后轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌感受態(tài)細(xì)胞，即得。4.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(1)中，PCR擴(kuò)增以谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增引物的核苷酸序列如下：F1:CGGGATCCCGTTTTTCATGCTTGCCGTCT；R1:AAGGCCAGCAAAA GCTAAAGCCCAAGAATGCAAC；PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下，總體系為50μl：PCR擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸30sec，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。5.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(2)中，PCR擴(kuò)增模板為穿梭質(zhì)粒pHT01的DNA；PCR擴(kuò)增引物的核苷酸序列如下：F2:GGTGGTCGGCATTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA；R2:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT；PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下，總體系為50μl...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王瑞明，汪俊卿，王蕾，王騰飛，李桂華，王建彬，隋松森，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：齊魯工業(yè)大學(xué)，諸城東曉生物科技有限公司，山東省飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：山東;37
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