發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面的構建方法及應用技術

本發明專利技術公開了一種發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面的構建方法及其應用，傳感界面的構建方法是將含亞甲基藍探針的腫瘤標志物適體I和含二茂鐵探針的腫瘤標志物適體II共同孵育后，修飾在表面修飾有納米金的電極表面即得；該方法獲得的發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面穩定性好，成本低，傳感界面可以分別檢測兩種腫瘤標志物，也可以在同一界面上同時檢測兩種腫瘤標志物，且具有檢測更簡單、檢出限低、靈敏度高、特異性強的特點。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面的構建方法以及用所述傳感界面同步檢測兩種腫瘤標志物的電化學方法；屬于電化學生物傳感器領域。
技術介紹
癌坯抗原CEA是一種蛋白多糖復合物，可廣泛存在于內胚葉起源的消化系統癌，是一個廣譜性腫瘤標志物，根據血清中CEA的含量初步判斷腫瘤的存在，評價療效，預估癌細胞生長狀況；MUC1粘蛋白是一種大分子量的糖蛋白，它在癌變上皮細胞表面高度異常表達，是一種常見腫瘤標志物，MUC1的血清水平還與腫瘤的惡性程度相關。因此對這兩種腫瘤標志物的檢測對癌細胞的偵探和檢測有十分重要的作用。但是在已有的檢測方法中，檢測的靈敏度檢和濃度范圍還有待提高，并且分布檢測效率低，為了更好的評估疾病的發展情況，對這兩種標志物的檢測顯得尤為重要，特別是如果能同時檢測兩種腫瘤標志物，將大大提高檢測效率和準確性。中國專利(申請號為201410181470.2)公開了一種同時檢測兩種急性白血病標志物的電化學傳感器的制備方法，具體公開了將溶菌酶報告探針和γ-干擾素報告探針分別在含有TCEP的溶液中靜置，以打開二硫鍵并分別與溶菌酶適體和γ-干擾素適體形成雙鏈結構；對金電極進行預處理，將處理好的金電極浸在預處理后的溶菌酶報告探針-適體雙鏈和γ-干擾素報告探針-適體雙鏈的混合液中，室溫靜置過夜，之后用二次蒸餾水和清洗液清洗；然后將電極浸在含有MCH的溶液中，以封閉電極，之后用二次蒸餾水和清洗液清洗；將上述步驟處理后的電極作為工作電極，和參比電極、對電極連接在化學工作站上，以得到可用于兩種急性白血病標志物溶菌酶和γ-干擾素的同時檢測電化學傳感器。但是其構建的傳感器和方法還存在以下明顯的缺點：1、兩種探針分別和對應的適體形成雙鏈時存在競爭反應；形成的兩種發夾結構連接到電極上又存在競爭反應，步驟繁瑣，傳感
器性質不穩定；2、接到電極上的分子存在四種形式：兩種探針分子及兩種發夾結構分子，每次接上去的有效的發夾結構的數量和比例不確定，其重復性差，并且兩種探針分子在電極上對檢測形成干擾；3、用到四種核酸分子鏈，造成傳感器的成本高。
技術實現思路
針對現有的檢測腫瘤標志物的方法存在的缺陷，本專利技術的目的是在于提供一種操作簡單、重復性好、成本低的構建發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面的方法，構建的傳感界面穩定性好、信號強、特異性高、靈敏度高，且可以用于檢測一種或同時檢測兩種腫瘤標記物。本專利技術的第二個目的是在于提供一種發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面的應用，該生物傳感器可以分別用于檢測兩種腫瘤標志物，也可以在同一界面上同時檢測兩種腫瘤標志物，且具有檢測更簡單、檢出限低、靈敏度高、特異性強的特點。為了實現上述技術目的，本專利技術提供了一種發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面的構建方法，該方法包括以下步驟：(1)在電極表面通過沉積法修飾納米金；(2)含亞甲基藍探針的腫瘤標志物適體I和含二茂鐵探針的腫瘤標志物適體II在25～40℃溫度下，于避光環境中，在溶液中混合孵育2～4h，得到孵育混合溶液；所述的孵育混合溶液中含亞甲基藍探針的腫瘤標志物適體I和含二茂鐵探針的腫瘤標志物適體II濃度分別為1～10μM和1～10μM；(3)在避光環境中，將表面修飾納米金的電極置于所述孵育混合溶液中，孵育14～16h后，用水沖洗；(4)再將(3)處理后的表面修飾納米金的電極置于MCH溶液中封閉，即得發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面。優選的方案，(1)中所述電極置于濃度為2～5mM的氯金酸溶液中，進行恒電位沉積，電位為-0.4V到-0.1V，沉積時間為150～200s，得到表面修飾納米金電極。在電極上沉積一層納米金顆粒后，電極比表面增大，一方面有利于結合適體，
另一方面可以大大增強信號強度，具備更高的檢測量。優選的方案，發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面包括含亞甲基藍(MB)探針的腫瘤標志物適體I和含二茂鐵(Fc)探針的腫瘤標志物適體II。較優選的方案，含亞甲基藍探針的腫瘤標志物適體I和含二茂鐵探針的腫瘤標志物適體II經過孵育后共同修飾在表面修飾納米金的電極表面。進一步優選的方案，腫瘤標志物適體I為CEA適體。進一步優選的方案，腫瘤標志物適體II為MUC1適體。本專利技術的方法構建的發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面采用適體來作用于相應的蛋白，具有更高的特異性和識別力，檢測的靈敏度更高；同時引入了兩種信號分子，分別檢測兩種不同腫瘤標記物，同時檢測時互不干擾，檢測限低，效率高。本專利技術還提供了所述方法構建的發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面的應用，將所述發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面應用于檢測腫瘤標志物適體I對應的腫瘤標志物I，或者檢測腫瘤標志物適體II對應的腫瘤標志物II，或者同時檢測腫瘤標志物適體I對應的腫瘤標志物I和腫瘤標志物適體II對應的腫瘤標志物II。本專利技術的傳感器可以分別檢測CEA和MUC1，而且也可以同時檢測CEA和MUC1，并且兩種腫瘤標記物的檢測分別對應兩種不同信號分子的變化量，特異性、獨立性和穩定性更高。優選的方案將發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面用于檢測腫瘤標志物I，根據腫瘤標志物I加入前后亞甲基藍電化學信號的變化量來檢測腫瘤標志物I的含量；或者，將發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面用于檢測腫瘤標志物II，根據腫瘤標志物II加入前后二茂鐵電化學信號的變化量來檢測腫瘤標志物II的含量；或者，將發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面用于同時檢測腫瘤標志物I和腫瘤標志物II，腫瘤標志物I和腫瘤標志物II同時加入，根據腫瘤標志物I加入前后亞甲基藍電化學信號的變化量來檢測腫瘤標志物I的含量，根據腫瘤標志物II加入前后二茂鐵電化學信號的變化量來檢測腫瘤標志物II的含量。較優選的方案，腫瘤標志物I為CEA。較優選的方案，腫瘤標志物II為MUC1。本專利技術的含亞甲基藍探針的腫瘤標志物適體I和含二茂鐵探針的腫瘤標志物適體II可以通過現有的常規方法篩選方法獲得。或者直接通過購買得到，如生工生物工程上海(股份)有限公司。本專利技術采用的含亞甲基藍探針的腫瘤標志物適體I和含二茂鐵探針的腫瘤標志物適體II一端修飾有巰基，主要通過巰基與電極表面的納米金鍵合，將相應的適體固定在電極表面。本專利技術采用的分子探針，Fc是還原性物質，于PBS中測量方波，在0.35V左右會有明顯的Fc的峰；根據方波電流的變化量，可以定量檢測MUC1的量。MB也是還原性物質，于PBS中測量方波，在-0.27V左右會有明顯的亞甲基藍的峰；根據方波電流的變化量，可以定量檢測CEA的量。相對現有技術，本專利技術技術方案帶來的有益技術效果：1)本專利技術的發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面的構建方法關鍵在于將兩種含不同分子探針的腫瘤標志物適體孵育雜交后，再修飾至表面修飾納米金的電極表面。該方法可以通過簡單調節孵育雜交過程中兩種腫瘤標志物適體濃度來實現兩種腫瘤標志物適體在電極表面的修飾比例，兩種適體進行雜交，不存在競爭關系，兩種分子雜交后形成一個整體，連接到電極上也不存在競爭，其可控性強，且構建的傳感界面修飾物成分穩定。完全克服了現有技術中的同時檢測兩種腫瘤標志物電化學傳感器存在穩定性差、重復性差的缺陷。2)通過本專利技術的方法構建的發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面，兩種含不同分子探針的腫瘤標志物適體通過共同孵育雜交本文檔來自技高網...

【技術保護點】
發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面的構建方法，其特征在于：包括以下步驟：(1)在電極表面通過沉積法修飾納米金；(2)含亞甲基藍探針的腫瘤標志物適體I和含二茂鐵探針的腫瘤標志物適體II在25～40℃溫度下，于避光環境中，在溶液中混合孵育2～4h，得到孵育混合溶液；所述的孵育混合溶液中含亞甲基藍探針的腫瘤標志物適體I和含二茂鐵探針的腫瘤標志物適體II濃度分別為1～10μM和1～10μM；(3)在避光環境中，將表面修飾納米金的電極置于所述孵育混合溶液中，孵育14～16h后，用水沖洗；(4)再將(3)處理后的表面修飾納米金的電極置于MCH溶液中封閉，即得發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面。

【技術特征摘要】
1.發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面的構建方法，其特征在于：包括以下步驟：(1)在電極表面通過沉積法修飾納米金；(2)含亞甲基藍探針的腫瘤標志物適體I和含二茂鐵探針的腫瘤標志物適體II在25～40℃溫度下，于避光環境中，在溶液中混合孵育2～4h，得到孵育混合溶液；所述的孵育混合溶液中含亞甲基藍探針的腫瘤標志物適體I和含二茂鐵探針的腫瘤標志物適體II濃度分別為1～10μM和1～10μM；(3)在避光環境中，將表面修飾納米金的電極置于所述孵育混合溶液中，孵育14～16h后，用水沖洗；(4)再將(3)處理后的表面修飾納米金的電極置于MCH溶液中封閉，即得發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面。2.根據權利要求1所述的發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面的構建方法，其特征在于：(1)中所述電極置于濃度為2～5mM的氯金酸溶液中，進行恒電位沉積，電位為-0.4V到-0.1V，沉積時間為150～200s，得到表面修飾納米金電極。3.根據權利要求1所述的發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面的構建方法，其特征在于：所述的發夾DNA支撐雙信號分子傳感界面包括含亞甲基藍探針的腫瘤標志物適體I和含二茂鐵探針的腫瘤標志物適體II。4.根據權利要求3所述的亞甲基藍和二茂鐵雙信號分子核酸適體傳感器，其特征在于：所述的含亞甲基藍探針的腫瘤標志物適體I和含二茂鐵探針的腫瘤標志物適體II經過孵育后共同修飾在表面修飾納米金的電極表...

【專利技術屬性】
技術研發人員：鄧春艷，皮曉梅，向娟，
申請(專利權)人：中南大學，
類型：發明
國別省市：湖南;43