一種從酶解液中分離核苷酸的方法技術

本文公開了一種從酶解液中分離核苷酸的方法，其具體過程為：在溫室下，將酶解液的pH調節至6～8之間，然后將溶液泵入電滲析裝置的淡化室中，并將一定量的純水泵入濃縮室中，充分循環后，將該裝置的陰極和陽極分別與直流電源的負極和正極相連接，設定膜堆兩端的電壓降為45V或者恒定電流0.5A，啟動電滲析裝置。在電滲析過程中用氫氧化鈉維持淡化室溶液的pH>6.0，當淡化室溶液的電導率<0.1ms/cm時停止電滲析。濃縮室中得到純度較高的核苷酸溶液，其在430納米下的透光率約為70?90％，比原料液提高了5倍以上，總收率大于95％。淡化室中殘留的總核苷酸<2％。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于電滲析在生物化工領域中的應用，具體涉及一種電滲析提純核苷酸的方法。
技術介紹
電滲析是在電場作用下，離子選擇性地透過離子交換膜，同時實現分離和濃縮的膜分離技術，因其具有操作簡單，不污染環境等特點，已在海水淡化、廢水處理、食品以及醫藥等方面得到廣泛的應用。目前電滲析技術因環境優勢已經越來越受到重視，已被廣泛用于發酵液中有機酸的脫鹽和分離過程中。如Chuanhui Huang等人(Journal of Membrane Science 288(2007)1–12)對電滲析法在有機酸生產方面做出了綜述；程桂石等(化工學報，2005(11),Vol 56,No 11；2200-2203)研究了電滲析法回收廚房垃圾發酵液中乳酸過程中pH的影響；Moon-Sung Kang等人(Journal of Membrane Science 222(2003)149–161)對大分子有機酸在電滲析中的分離特性進行了詳細的研究；Vu Hong Thang等人(Journal of Membrane Science 249(2005)173–182)對電滲析分離乳酸的工藝進行了詳細的闡述優化；孟洪等人(膜科學與技術,2003(2),Vol 23,No 1,7-11)闡述了電滲析過程中的濃差極化和水解機理，為工藝優化和防治膜污染奠定基礎。核苷酸是核糖核酸及脫氧核糖核酸的基本組成單位，是體內合成核酸的前身物。核苷酸隨著核酸分布于生物體內各器官、組織、細胞的核及胞質中，并作為核酸的組成成分參與生物的遺傳、發育、生長等基本生命活動。七十年代以來，隨著分子生物學和制藥工業的發展，核苷酸及其衍生物的研究和開發成為熱點，并逐漸形成了繼氨基酸之后的又一重要產業。核苷酸產品的用途十分廣闊，在食品行業中作為功能性食品添加劑，尤其是在嬰幼兒奶粉中的使用效果非常明顯，它的加入使奶粉更接近于母乳，能夠有效增強嬰幼兒抵抗細菌性痢疾的能力，減少腹瀉的發生；在醫藥領域，核苷酸作為醫藥中間體是許多核苷酸類衍生物的生產原料，在醫藥、人體和動物保健等方面也有著良好的應用效果和巨大的應用市場，其相關產品的全球銷售額高達上百億美元目前核苷酸的生產方法主要包括化學合成法和酶解法。其中酶解法由于無有機溶劑
和有毒化學試劑的殘留，而得到了廣泛的應用。酶解法是以酵母中提取的核糖核酸(RNA)為原料，利用核酸酶P1對其進行酶解，得到含4四種單核苷酸的混合溶液，再對其進行分離、精制，最后得到四種單核苷酸產品。由于酶解液中存在大量的蛋白質、多糖、色素和未完全酶解的寡聚核苷酸等雜質，傳統分離工藝流程長，導致產品的收率低，產品質量不穩定。其中對核苷酸酶解液進行脫色一般采用活性炭脫色的方法，但活性炭對核苷酸的吸附作用力強，導致產品回收率降低，且活性炭難于回收，易造成二次污染，使用成本較高。因此需要開發新的分離工藝來分離酶解液中核苷酸，以提高核苷酸的收率和純度。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是，提供一種收率高、無污染的分離核苷酸的方法。一種從酶解液中分離核苷酸的方法，包括如下步驟：(1)調節核苷酸酶解液的pH為6.0～9.0；(2)利用電滲析裝置濃縮得到四種核苷酸，工作電壓為10～60V，運行溫度為25℃，控制淡化室的pH大于6.0；(3)當淡化室的電導率下降至100μs/cm以下時，電滲析結束。其中，所述的核苷酸酶解液按照如下方法制備：(1a)酶解液的獲得：將RNA粉末按55g/L溶于水中，調節pH為5.5，加入核酸酶P1，在70℃下反應1h；(2a)向步驟(1a)的酶解液中加入15g/L的活性炭，70℃繼續酶解1h，在65℃條件加入殼聚糖絮凝劑，靜置20min，離心，收集上清液。步驟(2a)中，酶解液與殼聚糖絮凝劑的比例為9:1，所述殼聚糖絮凝劑中殼聚糖的濃度為10～12g/L，殼聚糖絮凝劑的pH為4.6～4.8。其中，電滲析結束之后，采用0.1mol/L的碳酸氫鈉水溶液，對電滲析膜堆進行倒極電滲析清洗0.5～1h，再用水對膜堆進行沖洗，使得濃縮室和淡化室流出溶液的pH值為6.5～7.5。其中，所述的電滲析裝置包括：組裝框架、陽極電極室、陰極電極室、鈦涂釕電極和電滲析膜堆，所述的陽極電極室和陰極電極室分別位于組裝框的兩側，所述鈦涂釕電極設置在陽極電極室和陰極電極室內，所述的電滲析膜堆由交替排列的陽離子交換膜、陰離子交換膜、隔網組成，陽極電極室和陰極電極室分別與直流電源的正極和負極相連。其中，所述的陽離子交換膜為CJMC-2磺酸型電滲析陽離子交換膜，陰離子交換膜為CJMA-2季銨型電滲析陰離子交換膜。其中，所述的電滲析膜堆的單元數為10對。有益效果：本專利技術是采用電滲析技術取代傳統從酶解液中提取核苷酸的技術，解決了傳統工藝中存在的步驟多，能耗大等問題，實現核苷酸的清潔生產，核苷酸回收率達到90％以上，整個分離系統實現基本零排放，是一項綠色分離技術，具有顯著的工業應用價值和環境效益。附圖說明圖1電滲析裝置的結構示意圖。圖2電滲析裝置的結構示意圖。圖3電滲析過程示意圖。具體實施方式根據下述實施例，可以更好地理解本專利技術。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本專利技術，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本專利技術。本專利技術用于核苷酸酶解液提純的電滲析器包括：電滲析膜堆單元，pH計，電導率儀，直流電源；電滲析膜堆單元包括：電滲析膜堆，流量計，輸液泵，組裝框架，管道；電滲析膜堆包括：若干交替排列的離子交換膜、隔板、電極板、夾緊裝置，從而構成電滲析膜堆的濃縮室，淡化室和電極室；以及濃縮水罐，淡化水罐，電極水罐。以下實施例中采用的陽離子交換膜為CJMC-2磺酸型電滲析陽離子交換膜，陰離子交換膜為CJMA-2季銨型電滲析陰離子交換膜。實施例1：1、酶解液配制方法：配制1L 5.5％的RNA溶液，RNA粉末55g，溶于蒸餾水(70℃)中，邊加邊攪拌，同時滴加5mol/L氫氧化鈉，調pH＝5.5，然后升溫至70℃；加入預熱15min的核酸酶P1酶液，加入量為6％(60mL)，反應3h 50min，所述核酸酶P1已經在申請號為201410818210.1的中國專利中詳細公開；2、酶解液的預處理：加入0.15％(1.5g)的活性炭，繼續酶解50min；然后降溫
至65℃，加入體積為10％(即100ml)，濃度為1％(即1g溶于100ml水中)的殼聚糖絮凝劑(配制方法為殼聚糖加入水中，然后加乙酸調pH至4.7左右)，靜置20min，取樣測透光度T430，應高于60％；降溫至45℃后進行離心(8000rpm 10min)；然后測透光T430。實施例2：采用本專利技術的電滲析方法從核苷酸酶解液中提取核苷酸。在室溫25℃下，選擇恒壓模式45V，循環間歇式操作，膜堆單元數為10對，膜面積為0.02m2。各室的條件如下：濃縮室為500ml模擬酶解液，pH為6，循環流量為20L/h；淡化室為300ml去離子水，循環流量為20L/h；電極室為0.3mol/L的硫酸鈉溶液，循環流量為20L/h。核苷酸模擬酶解液：核苷酸模擬酶解液中的4種核苷酸的總濃度為30g/L，但無其他雜質。電滲析處理時間120min后，濃室的體積增加16.6％，濃度提升1本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種從酶解液中分離核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)調節核苷酸酶解液的pH為6.0～9.0；(2)利用電滲析裝置濃縮得到四種核苷酸，工作電壓為10～60V，運行溫度為25℃，控制淡化室的pH大于6.0；(3)當淡化室的電導率下降至100μs/cm以下時，電滲析結束。

【技術特征摘要】
1.一種從酶解液中分離核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)調節核苷酸酶解液的pH為6.0～9.0；(2)利用電滲析裝置濃縮得到四種核苷酸，工作電壓為10～60V，運行溫度為25℃，控制淡化室的pH大于6.0；(3)當淡化室的電導率下降至100μs/cm以下時，電滲析結束。2.根據權利要求1所述的從酶解液中分離核苷酸的方法，其特征在于，所述的核苷酸酶解液按照如下方法制備：(1a)酶解液的獲得：將RNA粉末按55g/L溶于水中，調節pH為5.5，加入核酸酶P1，在70℃下反應1h；(2a)向步驟(1a)的酶解液中加入15g/L的活性炭，70℃繼續酶解1h，在65℃條件加入殼聚糖絮凝劑，靜置20min，離心，收集上清液。3.根據權利要求2所述的從酶解液中分離核苷酸的方法，其特征在于，步驟(2a)中，酶解液與殼聚糖絮凝劑的比例為9:1，所述殼聚糖絮凝劑中殼聚糖的濃度為10～12g/L，殼聚糖絮凝劑的pH為4.6～4.8。4.根據權利要...

【專利技術屬性】
技術研發人員：應漢杰，周精衛，匡瀚，吳菁嵐，莊偉，陳勇，畢志倩，
申請(專利權)人：南京工業大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32