本發(fā)明專利技術(shù)屬于害蟲抗藥性防治領(lǐng)域，具體涉及蛋白酶體抑制劑MG‐132作為菊酯類殺蟲劑的增效劑的應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)將蛋白酶體抑制劑MG‐132作為菊酯類殺蟲劑增效劑，用二甲基亞砜作為溶劑將蛋白酶體抑制劑MG‐132配制成30μM，再噴灑到田間小菜蛾的卵、幼蟲和飼料上進行預(yù)處理，預(yù)處理24小時后施菊酯類殺蟲劑。本發(fā)明專利技術(shù)通過個體和細胞水平分別證明MG‐132能顯著提高溴氰菊酯的防效。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于害蟲抗藥性防治領(lǐng)域，具體涉及蛋白酶體抑制劑MG‐132及一種治理小菜蛾的溴氰菊酯抗性的方法。
技術(shù)介紹
昆蟲對殺蟲劑的抗藥性是在藥劑的長期選擇作用下，昆蟲產(chǎn)生的一種生態(tài)適應(yīng)和進化現(xiàn)象。這種復(fù)雜的選擇過程顯然與多種代謝和調(diào)節(jié)相關(guān)，需要多種蛋白質(zhì)和酶的參與。蛋白酶體降解途徑是細胞內(nèi)降解蛋白質(zhì)的一個重要途徑，對于細胞許多生命功能的正常運行，例如細胞周期調(diào)控，基因表達，氧化應(yīng)激反應(yīng)等都是必不可少的。溴氰菊酯是人工合成擬除蟲菊酯殺蟲劑中殺蟲毒力最大的一個品種，性質(zhì)穩(wěn)定，殺蟲譜廣，生物活性高，在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用。小菜蛾對擬除蟲菊酯類藥劑的抗性發(fā)展速度快，抗性最為顯著。小菜蛾的抗藥性問題是十分嚴重的，抗性治理也有一定的難度，要有效解決這一問題，除了加速殺蟲劑新品種的開發(fā)外，更為切實可行的措施是增強現(xiàn)有殺蟲劑的殺蟲效果，延長其有效使用時間。MG-132是一種強效的,可逆的，細胞通透性的蛋白酶體抑制劑(IC50＝100nM)，與20S和26S蛋白酶體結(jié)合并使其失活。尚沒有將MG-132用于害蟲防治的報道。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供提高溴氰菊酯控制小菜蛾的方法及其應(yīng)用。本專利技術(shù)公開了蛋白酶體抑制劑MG-132作為菊酯類殺蟲劑的增效劑的應(yīng)用。本專利技術(shù)中所說的菊酯類殺蟲劑是溴氰菊酯殺蟲劑。所說的MG-132是蛋白酶體的特異性抑制劑。本專利技術(shù)進一步通過實驗研究蛋白酶體抑制劑MG‐132處理不同時間和不同處理濃度對對溴氰菊酯毒性的影響。(1)蛋白酶體抑制劑MG‐132處理不同時間對溴氰菊酯毒性的影響①首先用二甲基亞砜(DMSO)作為溶劑將蛋白酶體抑制劑配制成最終濃度為0μM，10μM，20μM，30μM，40μM和50μM。②將處于對數(shù)期的果蠅Kc細胞預(yù)先接種到96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24h。③將2μL濃度為30μM的MG-132加入到每孔中，繼續(xù)培養(yǎng)不同的時間(2h,4h,6h,8h,10h)。取各個時間點的細胞組進行下一步毒性檢測實驗。④向經(jīng)蛋白酶體抑制劑處理過的細胞中加入2μL濃度為30ppm的溴氰菊酯藥物(配制溴氰菊酯的溶劑為DMSO)。每個藥物濃度設(shè)有3個復(fù)孔。⑤藥物處理細胞24h后，用臺盼藍染色法檢測細胞存活率。⑥與對照組相比，計算細胞相對存活率。(2)蛋白酶體抑制劑MG‐132不同處理濃度對溴氰菊酯毒性的影響①基于上步的實驗結(jié)果，用不同濃度的蛋白酶體抑制劑(最終濃度為0μM，10μM，20μM，30μM，40μM和50μM)預(yù)處理對數(shù)期果蠅Kc細胞6h；②對經(jīng)蛋白酶體抑制劑處理過的細胞進行30ppm濃度的藥物刺激24h，每個濃度設(shè)有3個復(fù)孔；③臺盼藍染色法檢測細胞存活率。(具體操作方法同前)。(3)在施藥之前用MG‐132處理幼蟲24小時，可明顯提高防效。經(jīng)研究表明：(1)蛋白酶體抑制劑對細胞蛋白酶體活性呈可逆性抑制現(xiàn)象。(2)MG-132預(yù)處理，能顯著提高溴氰菊酯處理細胞的死亡率。(3)。MG-132預(yù)處理，使溴氰菊酯抗性品系小菜蛾的抗性水平顯著下降。進一步地，本專利技術(shù)提供了蛋白酶體抑制劑MG‐132作為菊酯類殺蟲劑增效劑的具體應(yīng)用方法，是用二甲基亞砜作為溶劑將蛋白酶體抑制劑MG‐132配制成30μM，再噴灑到田間小菜蛾的卵、幼蟲和飼料上進行預(yù)處理，預(yù)處理24小時后施菊酯類殺蟲劑。本專利技術(shù)通過個體和細胞水平分別證明MG-132能顯著提高溴氰菊酯的防效，因此本專利技術(shù)在抗性的防治應(yīng)用中具有重要的意義。附圖說明圖1特定濃度蛋白酶體抑制劑處理不同時間對細胞活性的影響(*代表p<0.05)。圖2不同濃度蛋白酶體抑制劑MG-132處理對細胞活性的影響對照:僅用溴氰菊酯藥物處理的對照組細胞；MG-132:用30ppm溴氰菊酯和相應(yīng)濃度蛋白酶體抑制劑處理的細胞；*代表p<0.05。具體實施方式實施例一1、小菜蛾抗性品系小菜蛾源自貴州省貴陽市花溪區(qū)中曹鄉(xiāng)的甘藍地，室內(nèi)繁殖一代后測四齡幼蟲的LD50值，與武漢市蔬菜研究所的小菜蛾敏感品系四齡幼蟲LD50值比較，發(fā)現(xiàn)小菜蛾田間種群為敏感種群。將其作為敏感品系同步隔離培養(yǎng)。小菜蛾溴氰菊酯抗性品系(抗性倍數(shù)>5000)由點滴法處理小菜蛾四齡幼蟲敏感品系經(jīng)多代繁育選育而成。2、MG‐132對溴氰菊酯毒性的影響(1)特定濃度MG-132處理不同時間所引起的細胞活性的變化首先用特定濃度(30μM)的蛋白酶體抑制劑MG-132預(yù)處理果蠅Kc細胞不同時間(0h,2h,4h,6h,8h,10h)，分別對每組細胞進行DM藥物(30ppm)處理，CCK-8試劑盒進行細胞毒性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體抑制劑對細胞蛋白酶體活性呈可逆性抑制現(xiàn)象，并且在預(yù)處理6h時，抑制效果達到最佳(附圖1)。(2)不同濃度MG-132處理相同時間所引起的細胞活性的變化在上步實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，用不同濃度的蛋白酶體抑制劑MG-132預(yù)處理果蠅細胞6h，再用濃度為30ppm溴氰菊酯藥物脅迫細胞，毒性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)MG-132預(yù)處理的果蠅細胞的死亡率明顯高于未經(jīng)MG-132處理的對照組(control)細胞，并且在高濃度的MG-132誘導(dǎo)下，果蠅細胞出現(xiàn)大面積的凋亡(附圖2)。3、MG‐132對小菜蛾溴氰菊酯抗性水平的影響(1)MG‐132預(yù)處理挑選生長狀態(tài)良好的抗性品系小菜蛾(DR)幼蟲作為實驗材料，腹腔顯微注射蛋白酶體抑制劑(MG-132)(購自Sigma-Aldrich公司)24h后進行活體水平毒性檢測(臨用前用二甲基亞砜溶解配成30μM)，在相同的條件下，對照組小菜蛾幼蟲腹腔則同時注射等體積的二甲基亞砜(DMSO)。采用點滴法分別對實驗組和對照組幼蟲進行毒力測定(蘭亦全和趙士熙,2003)。(2)毒性檢測小菜蛾幼蟲經(jīng)MG-132預(yù)處理24h后，用毛細微量進樣器將1μL溴氰菊酯藥劑點在幼蟲的前胸背板上，每個濃度的藥劑分別處理50只小菜蛾幼蟲，然后放入用紗布封口的培養(yǎng)皿中，人工喂食蘿卜苗。飼喂48h后統(tǒng)計不同濃度藥劑處理組幼蟲的死亡數(shù)，以輕觸蟲體不能協(xié)調(diào)活動視為判斷死亡標準。注：毒力測定實驗設(shè)有3次生物學(xué)重復(fù)。(3)經(jīng)MG-132處理后抗性品系小菜蛾幼蟲對溴氰菊酯毒力的變化抗性品系小菜蛾幼蟲經(jīng)不同濃度的溴氰菊酯藥物處理48h后，人工記錄各藥物濃度處理組幼蟲的死亡數(shù)，采用SPSS軟件進行毒力回歸分析得出參數(shù)估計和回歸方程檢驗表、95％的置信區(qū)間。通過分析得出小菜蛾抗性品系的毒力回歸方程為Probit(P)＝-1.943+1.017x，當P＝0.5時，查得LC50值為16.9ppm，95％的置信區(qū)間為9.76～15.35。為了進一步研究蛋白酶體活性的改變與溴氰菊酯應(yīng)激反應(yīng)之間的關(guān)系，蛋白酶體抑制劑MG-132被用來處理抗性品系小菜蛾幼蟲，經(jīng)MG-132預(yù)處理后，再分別對處理組和未處理組的小菜蛾幼蟲進行溴氰菊酯毒力測定。三次獨立的生物學(xué)實驗的結(jié)果經(jīng)分析得：當?shù)鞍酌阁w的活性被抑制劑MG-132抑制之后，小菜蛾抗性品系對農(nóng)藥溴氰菊酯的LC50的值被顯著下調(diào)。結(jié)果如表1所示。表1.經(jīng)MG-132處理后抗性品系小菜蛾幼蟲對溴氰菊酯毒力的變化n:代表幼蟲總數(shù)；*代表p﹤0.05。本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
蛋白酶體抑制劑MG?132作為菊酯類殺蟲劑的增效劑的應(yīng)用。
【技術(shù)特征摘要】
1.蛋白酶體抑制劑MG-132作為菊酯類殺蟲劑的增效劑的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的應(yīng)用，其特征在于：其中所說的菊酯類殺蟲劑是溴氰菊酯殺蟲劑。3.根據(jù)權(quán)利要求1所說的應(yīng)用，其特征在于：其中所說的MG-132是...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：程羅根，程晨，胡俊麗，李風(fēng)良，
申請(專利權(quán))人：南京師范大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32
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