多個核酸靶標的分析方法技術

本公開提供即使同時檢測的核酸靶標的種類增加，檢測熒光的光學系統也不變得復雜，能通過小型、廉價的構成分析多個核酸靶標的方法。本公開涉及的檢測裝置具備PCR處理部、邊界檢測部和檢測部，所述PCR處理部對在流路中流淌的第1液滴至第4液滴進行PCR處理，所述邊界檢測部檢測從PCR處理后的第1液滴至第4液滴輸出的熒光強度，并基于熒光強度，獲得在第5流路中流淌的第1液滴至第4液滴各自之間的邊界，所述檢測部基于熒光強度和第1液滴至第4液滴各自之間的邊界，獲得具有第1閾值以上的熒光強度的第2液滴和第4液滴的數，并基于第2液滴和第4液滴的數檢測對象核酸靶標中是否包含選自第1核酸靶標和第2核酸靶標中的至少1種。

【技術實現步驟摘要】

本公開涉及核酸靶標的分析方法。
技術介紹
作為用于實現核酸靶標分析的基本技術，一般采用以下方法：使用稱為PCR(聚合酶鏈反應)的技術，使DNA、RNA等的核酸中的所希望的核酸靶標擴增至檢測所需的量，進行檢測。另外，作為其發展形式，一般使用稱為qPCR(定量PCR，quantitative PCR)的定量分析技術。這些核酸靶標的定量分析技術被導入到微流路芯片內的小型反應器等中。專利文獻1中關于對基因進行定量分析的qPCR記載了基本的實現方法。該專利文獻1中記載了以下方法：使包含單鏈DNA的樣品，與具有靶標DNA的序列鏈的第一區域的互補序列的寡核苷酸(長度較短的DNA/RNA的序列)、以及包含相同靶標DNA的序列鏈的第二區域的互補序列的標記寡核苷酸接觸，在發生雜交的條件下形成雙鏈復合體的混合物，通過5’→3’核酸酶活性來切斷退火后的標記寡核苷酸而使標記片段游離，檢測該游離的標記片段。作為標記寡核苷酸的標記片段，如果使用熒光色素和猝滅劑，則在標記片段游離時才發出熒光，因而通過重復上述工藝，熒光強度越來越強。一般地，發生雜交的條件、產生核酸酶活性的條件等，可通過使樣本暴露于一定溫度條件來實現。即，重復上述工藝，是指對樣本重復規定的溫度的升高降低(溫度循環)。通過用光檢測器來檢測該熒光強度的強弱，調整上述工藝的重復次數(溫度循環的次數)與熒光強度的強弱的關系，可以分析以怎樣的程度含有靶標DNA的所希望的序列鏈。在對每一樣本檢測多個部位的靶標的情況下，準備與各個序列鏈互補的標記
寡核苷酸，通過使每個標記寡核苷酸的成為標記的熒光色素的材料、波長不同，可以在光檢測器中根據熒光波長的差進行分離分析。另外，專利文獻2中對于對基因進行定量分析的方法公開了實現方法的一例。特別是公開了使用了乳化技術的高通量檢定的改善技術。該方法使用乳化技術，制作出作為生化反應用的獨立的反應腔室發揮功能的液滴，使用這些液滴來對各個亞成分(細胞、核酸、蛋白質等)進行處理、檢查。使包含DNA/RNA等的水滴在油中懸浮，能夠制作水進入油中的狀態的乳劑。用表面活性劑使該乳劑穩定化，能夠使加熱、冷卻、運輸中的液滴的結合減少或消失，由此能夠實施在PCR技術等中進行的溫度循環。因此，利用了PCR的液滴中的核酸靶標分子的單拷貝擴增使用乳劑來實施?；诓此山y計來分析這些液滴內對某個靶標為陽性的液滴，能夠推定樣本中的靶標的濃度。在利用液滴的檢定中，使用1種或多種熒光體作為液滴中的標記，從而得知是否發生擴增等反應。通過生成液滴、使其反應、接著測定從各液滴放出的光，從而能夠判斷液滴中是否存在靶標。如果使能夠區分的不同的熒光體分別對應于每個不同的靶標，則能夠測定每個液滴中是否存在多個不同的靶標。這樣在區別多個不同的靶標的情況下，一般使用以下方法：使用多種熒光體、即發出不同波長的熒光的色素材料，根據其熒光波長來區別。在專利文獻2中，公開了使用2種熒光色素，各自區別地檢測的方法。設計分別對應于第1色素、第2色素的檢測構成(包含光源和檢測器)，在液滴通過流路的檢測區域時，用對應于第1色素的檢測構成和對應于第2色素的檢測構成交互地檢測液滴，從而實現?，F有技術文獻專利文獻專利文獻1：日本特許第2825976號公報專利文獻2：日本特表2013-524169號公報
技術實現思路
專利技術所要解決的課題然而在現有的構成中，在DNA/RNA等核酸中同時檢測作為目標的多個核酸靶標時，需要準備具有與各個核酸靶標的堿基序列互補的堿基序列的引物、探針等的反應藥液，將修飾引物、探針等的熒光色素對每個核酸靶標分別變更，從而進行分離檢測。另外，需要用于激發各個熒光色素的光源、用于檢測各個熒光色素的熒光波長的光學系統。存在隨著同時檢測的核酸靶標的種類增加，對應的熒光色素的準備、檢測熒光的光學系統變得復雜的課題。本公開的目的在于提供在同時檢測的核酸靶標的種類增加的情況下，檢測熒光的光學系統也不變得復雜的、通過小型、廉價的構成來分析多個核酸靶標的方法。用于解決課題的技術方案本公開的使用微流路芯片來檢測第1核酸靶標和第2核酸靶標的檢測方法包括：(a)在檢測裝置中設置微流路芯片，所述檢測裝置具備PCR處理部、PCR反應器、熒光檢測部和檢測電路，所述微流路芯片具備第1流路、第2流路、第3流路、第4流路和第5流路，所述第1流路的一端、所述第2流路的一端以及所述第3流路的一端與所述第4流路連接，所述PCR反應器位于所述第4流路和所述第5流路的之間，(b)通過(ⅰ)從所述第1流路的另一端依次供給第1水溶液、第1油和第2水溶液，(ⅱ)從所述第2流路的另一端供給樣品水溶液，和(ⅲ)從所述第3流路的另一端供給第2油，從而使由所述第1水溶液和所述樣品水溶液組成的第1液滴、由所述樣品水溶液組成的第2液滴、由所述第2水溶液和所述樣品水溶液組成的第3液滴以及由所述樣品水溶液組成的第4液滴依次通過所述第4流路，其中，所述第1水溶液具有第1DNA，所述第1DNA具有與所述第1核酸靶標互補的序列、并且被第1熒光色素修飾，所述第2水溶液具有第2DNA，所述第2DNA具有與所述第2核酸靶標互補的序列、并且被第2熒光色素修飾，(c)將通過所述第4流路到達所述PCR反應器的所述第1液滴至所述第4液滴，通過所述PCR處理部進行PCR處理，使所述PCR處理后的所述第1液滴至所述第4液滴通過所述第5流路，(d)所述第1液滴至所述第4液滴在所述第5流路中流淌時，通過所述熒光檢測部，檢測從所述第1液滴至所述第4液滴輸出的熒光強度，(e)基于所述熒光強度，獲得在所述第5流路中流淌的所述第1液滴至所述第4液滴各自之間的邊界，(f)通過所述檢測電路，基于所述熒光強度、和所述第1液滴至所述第4液滴各自之間的邊界，獲得具有第1閾值以上的熒光強度的所述第2液滴和所述第4液滴的數量，并且基于所述第2液滴和所述第4液滴的數量，檢測所述樣品水溶液中是否包含選自所述第1核酸靶標和所述第2核酸靶標中的至少1種。專利技術的效果根據本公開的多個核酸靶標的分析方法，在同時檢測的核酸靶標增加的情況下，也能夠不使微流路芯片的流路構成復雜化，另外，可以使用同一波長的修飾與核酸靶標一對一地反應的反應藥液的熒光色素，因此檢測熒光的光波導單元能夠以簡單的構成實現。由此，能夠提供小型且廉價的裝置構成。附圖說明圖1的上層是顯示在微流路芯片的光波導單元的一支流路中流通的多個液滴群的概略圖，下層是顯示對于多個液滴群測量的輸出信號的一例的圖。圖2是顯示反應藥液庫的構成的一例的概略圖。圖3A是切下實施方式1所涉及的微流路芯片的流路的一部分的剖面后的立體圖。圖3B是顯示微流路芯片的構成的一例的概略圖。圖4A是顯示實施方式1中的流路合流部的構成的一例的概略圖。圖4B是顯示實施方式1中的流路合流部的構成的一例的概略圖。圖5是顯示PCR用反應器的構成的一例的概略圖。圖6A是顯示使用了TaqMan探針的PCR的各過程的概略圖。圖6B是顯示使用了TaqMan探針的PCR的各過程的概略圖。圖6C是顯示使用了TaqMan探針的PCR的各過程的概略圖。圖7是顯示實施方式1中的微流路芯片的光波導單元和核酸靶標分析裝置的光學系統的構成的一例的概略圖。圖8的上層是顯示在微流路芯片的光波導單元的一支流路中流通的多本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測方法，是使用微流路芯片來檢測第1核酸靶標和第2核酸靶標的檢測方法，包括：(a)在檢測裝置中設置微流路芯片，所述檢測裝置具備PCR處理部、PCR反應器、熒光檢測部和檢測電路，所述微流路芯片具備第1流路、第2流路、第3流路、第4流路和第5流路，所述第1流路的一端、所述第2流路的一端以及所述第3流路的一端與所述第4流路連接，所述PCR反應器位于所述第4流路和所述第5流路的之間，(b)通過(ⅰ)從所述第1流路的另一端依次供給第1水溶液、第1油和第2水溶液，(ⅱ)從所述第2流路的另一端供給樣品水溶液，和(ⅲ)從所述第3流路的另一端供給第2油，從而使由所述第1水溶液和所述樣品水溶液組成的第1液滴、由所述樣品水溶液組成的第2液滴、由所述第2水溶液和所述樣品水溶液組成的第3液滴以及由所述樣品水溶液組成的第4液滴依次通過所述第4流路，其中，所述第1水溶液具有第1DNA，所述第1DNA具有與所述第1核酸靶標互補的序列、并且被第1熒光色素修飾，所述第2水溶液具有第2DNA，所述第2DNA具有與所述第2核酸靶標互補的序列、并且被第2熒光色素修飾，(c)將通過所述第4流路到達所述PCR反應器的所述第1液滴至所述第4液滴，通過所述PCR處理部進行PCR處理，使所述PCR處理后的所述第1液滴至所述第4液滴通過所述第5流路，(d)所述第1液滴至所述第4液滴在所述第5流路中流淌時，通過所述熒光檢測部，檢測從所述第1液滴至所述第4液滴輸出的熒光強度，(e)基于所述熒光強度，獲得在所述第5流路中流淌的所述第1液滴至所述第4液滴各自之間的邊界，(f)通過所述檢測電路，基于所述熒光強度、和所述第1液滴至所述第4液滴各自之間的邊界，獲得具有第1閾值以上的熒光強度的所述第2液滴和所述第4液滴的數量，并且基于所述第2液滴和所述第4液滴的數量，檢測所述樣品水溶液中是否包含選自所述第1核酸靶標和所述第2核酸靶標中的至少1種。...

【技術特征摘要】
2015.03.10 JP 2015-0475251.一種檢測方法，是使用微流路芯片來檢測第1核酸靶標和第2核酸靶標的檢測方法，包括：(a)在檢測裝置中設置微流路芯片，所述檢測裝置具備PCR處理部、PCR反應器、熒光檢測部和檢測電路，所述微流路芯片具備第1流路、第2流路、第3流路、第4流路和第5流路，所述第1流路的一端、所述第2流路的一端以及所述第3流路的一端與所述第4流路連接，所述PCR反應器位于所述第4流路和所述第5流路的之間，(b)通過(ⅰ)從所述第1流路的另一端依次供給第1水溶液、第1油和第2水溶液，(ⅱ)從所述第2流路的另一端供給樣品水溶液，和(ⅲ)從所述第3流路的另一端供給第2油，從而使由所述第1水溶液和所述樣品水溶液組成的第1液滴、由所述樣品水溶液組成的第2液滴、由所述第2水溶液和所述樣品水溶液組成的第3液滴以及由所述樣品水溶液組成的第4液滴依次通過所述第4流路，其中，所述第1水溶液具有第1DNA，所述第1DNA具有與所述第1核酸靶標互補的序列、并且被第1熒光色素修飾，所述第2水溶液具有第2DNA，所述第2DNA具有與所述第2核酸靶標互補的序列、并且被第2熒光色素修飾，(c)將通過所述第4流路到達所述PCR反應器的所述第1液滴至所述第4液滴，通過所述PCR處理部進行PCR處理，使所述PCR處理后的所述第1液滴至所述第4液滴通過所述第5流路，(d)所述第1液滴至所述第4液滴在所述第5流路中流淌時，通過所述熒光檢測部，檢測從所述第1液滴至所述第4液滴輸出的熒光強度，(e)基于所述熒光強度，獲得在所述第5流路中流淌的所述第1液滴至所述第4液滴各自之間的邊界，(f)通過所述檢測電路，基于所述熒光強度、和所述第1液滴至所述第4液滴各自之間的邊界，獲得具有第1閾值以上的熒光強度的所述第2液滴和所述第4液滴的數量，并且基于所述第2液滴和所述第4液滴的數量，檢測所述樣品水溶液中是否包含選自所述第1核酸靶標和所述第2核酸靶標中的至少1種。2.根據權利要求1所述的檢測方法，在所述工序(b)中，(ⅳ)在所述第1流路中流淌的所述第1水溶液、所述第1油和所述第2水溶液的流速，(ⅴ)在所述第2流路中流淌的所述樣品水溶液的流速，以及(ⅵ)在所述第3流路中流淌的所述第2油的流速是一定的。3.根據權利要求1所述的檢測方法，所述第4流路的一端與所述第1流路的一端、所述第2流路的一端以及所述第3流路的一端連接。4.根據權利要求1所述的檢測方法，所述第4流路的一端與所述第1流路的一端以及所述第2流路的一端連接，所述第3流路的一端與所述第4流路的所述一端和另一端之間連接。5.根據權利要求1所述的檢測方法，在所述工序(d)中檢測多個熒光強度的變化，其中，所述多個熒光強度的變化是第2閾值以上的所述熒光強度的變化，在所述工序(e)中，基于各個檢測到所述多個熒光強度的變化的位置，作為選自(ⅶ)所述第1液滴與所述第2液滴之間的邊界、(ⅷ)所述第2液滴與所述第3液滴之間的邊界、(ⅸ)所述第3液滴與所述第4液滴之間的邊界和(ⅹ)所述第4液滴與所述第1液滴之間的邊界中的至少1個邊界而獲得，從而獲得多個邊界。6.根據權利要求5所述的檢測方法，所述多個熒光強度的變化包含第1熒光強度的變化和第2熒光強度的變化，在所述工序(e)中，基于檢測到所述第1熒光強度的變化的時刻和檢測到所述第2熒光強度的變化的時刻之間的時間間隔，確定所述第2液滴和所述第4液滴，從而獲得所述第1液滴至所述第4液滴各自之間的邊界。7.根據權利要求6所述的檢測方法，在所述工序(e)中，在所述時間間隔為規定時間以上的情況下，獲得與所述第2熒光強度的變化對應的邊界，作為(ⅷ)所述第2液滴與所述第3液滴之間的邊界或(ⅹ)所述第4液滴與所述第1液滴...

【專利技術屬性】
技術研發人員：佃雅彥，
申請(專利權)人：松下知識產權經營株式會社，
類型：發明
國別省市：日本;JP